Meetaabolayitoonni immunomodulatory amala ijoo naannoo maaykiroo tumoor (TME) yoo ta’an, garuu muraasa irraa kan hafe eenyummaan isaanii baay’inaan hin beekamu. Asitti, nuyi meetaaboloomii kutaalee TME adda addaa kanaa mul'isuuf, tumoors fi seelota T tumors fi ascites dhukkubsattoota sadarkaa olaanaa serous carcinoma (HGSC) irraa xiinxalle. Ascites fi seelonni tumoor garaagarummaa meetaabolayitii bal’aa qabu. Ascites wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu, seelonni T tumor-infiltrating 1-methylnicotinamide (MNA) baay'ee badhaadhina qabu. Sadarkaan MNA seelii T keessatti olka’aa ta’us, ibsi nikotinaamaayidii N-methyltransferase (inzaayimii gareewwan meetiilii S-adenosylmethionine irraa gara nicotinamide tti dabarsuu katalaayizii godhu) fibroblasts fi seelota tumoor qofa irratti daangeffama. Hojiidhaan, MNA seelonni T saayitookinii tumoor neekroosiis faaktarii alfaa kan tumoor guddisu akka dhangalaasaniif kakaasa. Kanaafuu, MNA TME irraa argame dambii ittisa qaamaa seelii T keessatti gumaacha kan godhu yoo ta'u, wal'aansa kaansarii namaatiif galma immunotherapy ta'uu danda'u bakka bu'a.
Meetaabolayitoonni tumoor irraa argamanii dandeettii farra tumoor irratti dhiibbaa gadi fagoo dhorkuu kan danda’an yoo ta’u, ragaaleen baay’achaa dhufan akka agarsiisanitti, guddina dhukkubichaaf humna sochootuu ijoo ta’aniis tajaajiluu akka danda’an agarsiisa (1). Bu’aa Warburg malees, hojiin dhiheenya kana haala meetaabolii seelii tumoor fi hariiroo inni haala ittisa qaamaa naannoo maaykiroo tumoor (TME) waliin qabu adda baasuu eegaleera. Qorannoon moodeelota hantuutaa fi seelii T namaa irratti gaggeeffame akka agarsiisutti meetaaboliizimiin gilutaamiinii (2), meetaaboliizimiin oksijiinii (3) fi meetaaboliizimiin gilukoosii (4) gareewwan xiqqaa seelii ittisa qaamaa adda addaa irratti of danda’ee socho’uu danda’a. Meetaabolayitoonni hedduun karaalee kanneen keessa jiran dalagaa farra tumoor seelii T dhorku. Uggurri koo-inzaayimii tetrahydrobiopterin (BH4) baay’ina seelii T miidhuu akka danda’u, akkasumas BH4 qaama keessatti dabaluunis deebii ittisa farra tumoor CD4 fi CD8 gidduu galeessa ta’e guddisuu akka danda’u mirkanaa’eera. Kana malees, bu'aan immunosuppressive kynurenine bulchiinsa BH4tiin baraaruu danda'a (5). Isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant glioblastoma keessatti, dhangalaa'uun enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) T seelii activation, baay'ina fi cytolysis Activity dhorka (6). Dhiheenya kana, meetiigililaayooksaal, oomisha cinaa gilaayikoolayizisii, seelii ukkaamsaa ka’umsa maayilooyidiitiin kan oomishamu yoo ta’u, dabarsaan seelii T meetilaayiksaal dalagaa seelii T eeffeektaraa dhorkuu akka danda’u agarsiifameera. Wal'aansa keessatti, neutralization methylglyoxal sochii myeloid-derived suppressor cells (MDSC) mo'uu fi synergistically checkpoint blockade therapy moodeelota hantuutaa keessatti guddisuu danda'a (7). Qorannoowwan kun walumaa galatti gahee ijoo meetaabolayitoota TME irraa argamanii dalagaa fi sochii seelii T to’achuu keessatti qaban cimsanii ibsu.
Kaansarii ovaarii keessatti hojii dhabuun seelii T bal’inaan gabaafameera (8). Kunis gartokkoon amala meetaabolii haaypoksiyaa fi ujummoolee dhiigaa hin baramne (9) keessatti uumaman irraa kan ka’e yoo ta’u, kunis gilukoosii fi tiriiptoofan gara oomishaalee cinaa kanneen akka asiidii laktik fi kynurenine tti akka jijjiiramu taasisa. Laakteetiin seelii ala garmalee oomisha interfeeroon-γ (IFN-γ) hir'isuu fi addaan baafamuu gareewwan xiqqaa maayiloosuppressive oofaa ( 10 , 11 ). Fayyadamni tiraayiptoofan kallattiin baay’ina seelii T dhorkuu fi mallattoo fudhataa seelii T dhorka (12-14). Tajaajilli kun jiraatus, hojiin baay'een meetaabolii ittisa qaamaa marsee aadaa seelii T in vitro keessatti miidiyaa fooyya'e fayyadamuun raawwatameera, ykn moodeelota hantuutaa homologous in vivo keessatti daangeffame, isaan lamaan guutummaatti heterogeneity kaansarii namaa fi naannoo Physiological macro fi micro hin calaqqisiisu.
Wanti kaansarii ovaarii beekamaa ta’e babal’ina peritoneal fi mul’achuu ascites ti. Kuufamni dhangala’aan seelii ascites keessatti dhukkuba sadarkaa olaanaa fi raajii gaarii hin taane waliin walqabatee jira ( 15 ). Akka gabaasaaleen jedhanitti, kutaan addaa kun oksijiinii gadi aanaa kan qabu, guddina endothelial growth factor (VEGF) fi indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) sadarkaa olaanaa kan qabu yoo ta’u, seelii T regulatory fi seelota myeloid inhibitory (15-18) kan seenudha. Naannoo meetaabolii ascites kan ofii isaatii tumoor irraa adda ta’uu waan danda’uuf, seelonni T iddoo peritoneal keessatti irra deebiin saganteessuun isaanii ifa miti. Kana malees, garaagarummaan ijoo fi heterogeneity ascites fi metabolites naannoo tumor keessatti argaman gidduu jiru seelonni ittisa qaamaa fi hojii isaanii tumor irratti akka hin seenne gufachiisuu waan danda’uuf qorannoon dabalataa barbaachisaadha.
Rakkoolee kana furuuf, mala addaan baafamuu seelii miiraa fi dhangala'aa kiroomaatoogiraafii tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) gosoota seelii adda addaa (seelota CD4 + fi CD8 + T dabalatee) akkasumas firii keessaa fi gidduutti qorachuuf dizaayinii goone Meetaabolayitoonni isaa seelii ascites fi naannoo tumoor walfakkaataa dhukkubsataa keessatti argaman span. Nu mala kana fayyadamna high-dimensional flow cytometry fi single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) waliin ta'uun suuraa haala meetaabolii uummata ijoo kanaa baay'ee furmaata ta'e kennuudhaaf. Malli kun sadarkaan 1-methylnicotinamide (MNA) seelii T tumoor keessatti dabaluu guddaa kan mul’ise yoo ta’u, yaalii in vitro keessatti dhiibbaan immunomodulatory MNA dalagaa seelii T irratti qabu kanaan dura akka hin beekamne agarsiiseera. Walumaagalatti, malan kun wal-nyaatinsa meetaabolii waliinii firii fi seelii ittisa qaamaa gidduu jiru kan mul’isu yoo ta’u, meetaabolayitoota dambii ittisa qaamaa irratti hubannoo addaa kan kennu yoo ta’u, kunis wal’aansa wal’aansa kaansarii ovaarii kan seelii T irratti hundaa’e carraa wal’aansa wal’aansaaf faayidaa qabaachuu danda’a.
Nu yeroo tokkotti fudhatama gilukoosii [2-(N-(7-naayitiroofeeniil-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) fi sochii maaytookondriyaa [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) wal cinaa typical mallattoolee seelii ittisa qaamaa fi baay’ina seelii tumoor adda baasu (Gabatee S2 fi Fakkii S1A). Xiinxalli kun akka agarsiisutti seelonni T waliin walbira qabamee yoo ilaalamu seelonni ascites fi tumoor sadarkaa fudhatama gilukoosii ol’aanaa kan qaban yoo ta’u, garuu garaagarummaa sochii maaytookondriyaa xiqqaa qabu. Giddugaleessi fudhatamni gilukoosii seelota tumoor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] kan seelii T dachaa sadii hanga afuriitti yoo ta’u, giddu galeessaan fudhatamni gilukoosii seelota CD4 + T kan seelii CD8 + T dachaa 1.2 yoo ta’u, kunis limfoosaayitoonni Tumor infiltrating (TIL) TME walfakkaataa keessattillee barbaachisummaa meetaabolii adda addaa akka qaban agarsiisa (Fakkii 1A). Faallaa kanaatiin, sochiin maaytookondriyaa seelii tumoor keessatti kan seelii CD4 + T wajjin kan walfakkaatu yoo ta’u, sochiin maaytookondriyaa gosoota seelii lamaan kan seelii CD8 + T caalaa ol’aanaadha (Fakkii 1B). Walumaagalatti bu’aawwan kun sadarkaa meetaabolii mul’isu. Sochiin meetaabolii seelii tumoor kan seelii CD4 + T caalaa kan caalu yoo ta’u, sochiin meetaabolii seelii CD4 + T kan seelii CD8 + T caalaa ol’aanaadha. Dhiibbaan kun gosoota seelii hunda keessatti jiraatus, haala meetaabolii seelii CD4 + fi CD8 + T ykn pirooppoorshinii isaanii kan walqabatu ascites keessatti tumors wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu hin jiru (Fakkii 1C). Faallaa kanaatiin, firaakshinii seelii CD45 keessatti, pirooppoorshiniin seelii EpCAM+ tumoor keessatti ascites wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu dabaleera (Fakkii 1D). Akkasumas garaagarummaa meetaabolii ifa ta'e qaamolee seelii EpCAM + fi EpCAM- gidduu jiru ilaalle. Seelonni EpCAM+ (tumor) seelonni EpCAM- caalaa fudhatama gilukoosii fi sochii maaytookondriyaa olaanaa kan qaban yoo ta’u, kunis sochii meetaabolii fibroblasts seelii tumoor TME keessatti argaman caalaa baay’ee ol’aanaadha (Fakkii 1, E fi F).
(A fi B) Cimina fluorescence gidduugaleessaa (MFI) fudhatama gilukoosii (2-NBDG) (A) fi sochii maaytookondriyaa seelii CD4 + T (MitoTracker diimaa dukkanaa’aa) (B) Giraaphii bakka bu’aa (bitaa) fi daataa gabatee (Mirga), seelii CD8 + T fi seelota EpCAM + CD45-tumor ascites fi tumoor irraa. (C) Reeshiyoo seelii CD4 + fi CD8 + (kan seelii CD3 + T) ascites fi tumoor keessatti. (D) Pirooppoorshinii seelii EpCAM + tumoor ascites fi tumoor (CD45−) keessatti. (E fi F) EpCAM + CD45-tumor fi EpCAM-CD45-matrix glucose fudhachuu (2-NBDG) (E) fi sochii mitochondrial (MitoTracker diimaa dukkanaa’aa) (F) giraafii bakka bu’oota (bitaa) fi daataa gabatee ( Mirga) Ascites fi seelii tumoor. (G) Giraaphii bakka bu’oota ibsa CD25, CD137 fi PD1 dhangala’aa saayitoomeetiriitiin. (H fi I) CD25, CD137 fi PD1 ibsa seelii CD4 + T (H) fi seelii CD8 + T (I) irratti. (J fi K) Feenootaayipoota naive, yaadannoo giddugaleessaa (Tcm), effector (Teff) fi effector memory (Tem) ibsa CCR7 fi CD45RO irratti hundaa’an. Fakkiiwwan bakka bu’oota (bitaa) fi daataa gabatee (mirga) seelii CD4 + T (J) fi seelii CD8 + T (K) ascites fi tumoor keessatti. Gatiin P qorannoo t-lamaan murtaa’an (*P<0.05, **P<0.01 fi ***P<0.001). Sararri kun dhukkubsattoota walsimsiisan bakka bu’a (n = 6). FMO, fluorescence tokko hir’isuun; MFI, cimina fluorescence gidduugaleessaa.
Xiinxalli dabalataa garaagarummaa guddaa biroo haala fenootayipii seelii T furmaata olaanaa qabu gidduu jiru mul’ise. Yaadannoo hojiirra oole (Fakkii 1, G hanga I) fi effector (Fakkii 1, J fi K) tumoor keessatti ascites (proportion of CD3 + T cells) caalaa baay’ee baay’eedha. Haaluma walfakkaatuun, fenootayipii ibsa mallattoolee hojiitti hiikuu (CD25 fi CD137) fi mallattoolee hir’isuu [pirootiinii du’a seelii sagantaa qabame 1 (PD1)] xiinxaluun amala meetaabolii uummata kanaa adda ta’us (Fakkii S1, B hanga E) , Garuu garaagarummaan meetaabolii guddaan tuuta xiqqaa naive, effector ykn yaadannoo gidduutti wal irraa hin cinne hin mul’anne (Fakkii S1, F hanga I). Bu’aawwan kunniin kan mirkanaa’e mala barumsa maashinii fayyadamuun ofumaan fenootayipii seelii (21) ramaduudhaan yoo ta’u, kunis daran seelonni lafee lafee baay’inaan (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ascites dhukkubsataa keessatti argamuun isaanii mul’ise (Fakkii S2A). Gosoota seelii adda baafaman hunda keessaa, baay’inni seelii maayilooyidii kun fudhatama gilukoosii fi sochii maaytookondriyaa olaanaa agarsiiseera (Fakkii S2, B hanga G). Bu’aan kunniin garaagarummaa meetaabolii cimaa gosoota seelii dachaa dhukkubsattoota HGSC keessatti ascites fi tumors keessatti argaman gidduu jiru kan calaqqisiisudha.
Amaloota meetaabonoomii TIL hubachuu keessatti qormaanni guddaan saamuda seelii T qulqullina, qulqullinaa fi baay’ina gahaa qabu dhibee mar’umaanii irraa adda baasuun barbaachisaa ta’uu isaati. Qorannoon dhiheenya kana godhame akka agarsiisutti malawwan sassaabuu fi badhaadhina bifa dhangala’aa saayitoomeetirii irratti hundaa’an jijjiirama piroofaayilii meetaabolayitii seelii fiduu danda’u (22-24). Rakkoo kana irra aanuuf, nuyi LC-MS / MS xiinxaluu dura kaansarii ovaarii namaa baqaqsanii hodhuun ciccirame irraa TIL adda baasuu fi adda baasuuf mala badhaadhina biid optimized (Meeshaalee fi Malawwan ilaali; Fakkii 2A). Dhiibbaa waliigalaa pirootokooliin kun jijjiirama meetaabolayitii irratti qabu madaaluuf, piroofaayilii meetaabolayitii seelii T arjoomtoota fayyaatiin hojiirra oolan tarkaanfii addaan baafamuu biidiin armaan olitti ibsame booda seelii biidiin adda hin baane garuu bubbee irratti hafe waliin wal bira qabnee ilaalle. Xiinxalli to’annoo qulqullinaa kun haalawwan lamaan kana gidduutti walitti dhufeenyi olaanaan akka jiru (r = 0.77), akkasumas irra deddeebiin teeknikaa garee meetaabolayitoota 86 irra deddeebi’amuu olaanaa akka qabu argateera (Fakkii 2B). Kanaafuu, maloonni kun seelii badhaadhina gosa seelii keessa jiran keessatti xiinxala meetaabolayitii sirrii raawwachuu danda’u, kanaanis HGSC keessatti meetaabolayitoota adda ta’an adda baasuuf waltajjii furmaata olaanaa isa jalqabaa ta’e kan kennu yoo ta’u, kanaanis namoonni waa’ee adda ta’uu seelii irratti hubannoo gadi fagoo Sagantaa meetaabolii saalaa akka argatan dandeessisa.
(A) Diyaagirama iskiimaatikii badhaadhina maagneetii biid. Seelonni LC-MS/MSn osoo hin xiinxalamiin dura marsaa sadii walitti aansuun badhaadhina maagneetii biid ni keessa darbu ykn bubbee irratti ni hafu. (B) Dhiibbaa gosti badhaadhina baay’ina meetaabolayitoota irratti qabu. Giddugaleessi safartuu sadii tokkoon tokkoon gosa badhaadhinaaf ± SE. Sararri halluu diimaa qabu hariiroo 1:1 bakka bu’a. Walqabsiisni gita keessaa (ICC) safartuuwwan irra deddeebi’amanii asxaa siiqqee keessatti agarsiifaman. NAD, nikootinaamaayidii adeeniinii daayinuukiliyootaayidii. (C) Diyaagirama iskiimaatikii adeemsa hojii xiinxala meetaabolayitii dhukkubsataa. Ascites ykn tumoor dhukkubsattoota irraa walitti qabamee cryopreserved ta’a. Tokkoon tokkoon saamuda keessaa kutaan xiqqaan dhangala’aa saayitoomeetiriitiin kan xiinxalame yoo ta’u, saamuda hafe ammoo marsaa sadii badhaadhina seelii CD4+, CD8+ fi CD45- keessa darbaniiru. Firaakshinoonni seelii kunniin LC-MS/MS fayyadamuun xiinxalamaniiru. (D) Kaartaa ho’aa baay’ina meetaabolayitii sadarkaa isaa eeggate. Deendroogiraamiin fageenya Yuukiliidii saamuda gidduu jiru tuuta Waard bakka bu’a. (E) Xiinxala qaamolee ijoo (PCA) kaartaa meetaabolayitii saamuda, tokkoon tokkoon saamuda irra deebi’amee sadii agarsiisu, saamuda dhukkubsataa tokko irraa sararaan walitti hidhame. (F) PCA piroofaayilii meetaabolayitii saamuda dhukkubsataa irratti haala mijeesse (jechuunis, gartokkoon hir’ina fayyadamuun); gosti saamudaa qaama saalaa konveeksiitiin daangeffama. PC1, qaama ijoo 1; PC2, qaama ijoo 2.
Itti aansuudhaan, mala badhaadhina kana hojiirra oolchuun meetaabolayitoota 99 firaakshinii seelii CD4 +, CD8 + fi CD45 keessatti ascites fi tumoors jalqabaa dhukkubsattoota HGSC jaha keessatti xiinxalle (Fakkii 2C, Fakkii S3A fi Gabatee S3 fi S4). Uummanni fedhii qabu saamuda guddaa jalqabaa seelii lubbuu qabu keessaa %2 hanga %70 kan ta’u yoo ta’u, pirooppoorshiniin seelii dhukkubsattoota gidduutti garaagarummaa guddaa qaba. Erga biidiiwwan addaan baafamanii booda, firaakshiniin fedhii badhaadhina qabu (CD4+, CD8+ ykn CD45-) giddu galeessaan seelii lubbuu qabu hunda keessaa %85 ol qaba. Malli badhaadhina kun meetaabolii tishuuwwan tumoor namaa irraa baay’ina seelii xiinxaluuf nu dandeessisa, kunis saamuda gurguddaa irraa gochuun hin danda’amu. Pirootokoolii kana fayyadamuun, l-kynurenine fi adenosine, meetaabolayitoota immunosuppressive amala gaarii qaban kun seelii T tumoor ykn seelii tumoor keessatti olka'aa akka turan murteessine (Fakkii S3, B fi C). Kanaafuu, bu’aawwan kun amanamummaa fi dandeettii teeknooloojiin addaan baafamuu seelii fi ispeektiroomeetirii baay’ee keenya tishuuwwan dhukkubsataa keessatti meetaabolayitoota baayoloojiidhaan barbaachisoo ta’an argachuuf qabu agarsiisu.
Xiinxalli keenyas gosoota seelii dhukkubsattoota keessaa fi gidduutti addaan bahuu meetaabolii cimaa mul'ise (Fakkii 2D fi Fakkii S4A). Keessattuu, dhukkubsattoota biroo wajjin walbira qabamee yoo ilaalamu, dhukkubsataan 70 amala meetaabolii adda addaa agarsiiseera (Fakkii 2E fi Fakkii S4B), kunis dhukkubsattoota gidduutti meetaabolii heterogeneity guddaan jiraachuu akka danda’u agarsiisa. Dhukkubsattoota biroo (liitira 1.2 hanga 2; Gabatee S1) waliin walbira qabamee yoo ilaalamu, hammi waliigalaa ascites dhukkubsataa 70 (80 ml) keessatti walitti qabame xiqqaa ta’uun isaa hubatamuu qaba. To'annoon heterogeneity dhukkubsattoota gidduutti yeroo xiinxala qaamolee ijoo (fakkeenyaaf, xiinxala gartokkee hir'ina fayyadamuun) gosoota seelii gidduutti jijjiirama walfakkaatu agarsiisa, gosootni seelii fi/ykn naannoo maaykiroo akkaataa piroofaayilii meetaabolayitiitiin ifatti walitti qabamaniiru (Fakkii 2F). Xiinxalli meetaabolayitoota tokkoo bu’aa kana cimsee kan ibse yoo ta’u, gosoota seelii fi naannoo maaykiroo gidduu garaagarummaa guddaa mul’ise. Garaagarummaan garmalee guddaan mul’ate MNA yoo ta’u, kunis yeroo baay’ee seelii CD45- fi seelii CD4+ fi CD8+ kanneen qaama dhiitaa keessa seenan keessatti kan badhaadhedha (Fakkii 3A). Seelii CD4 + tiif, bu’aan kun baay’ee kan mul’atu yoo ta’u, MNA seelii CD8 + keessa jirus naannoodhaan dhiibbaa cimaa kan qabu fakkaata. Haa ta’u malee, kun barbaachisaa miti, sababiin isaas dhukkubsattoota ja’a keessaa sadii qofatu qabxii CD8+ tumoor madaalamuu danda’a. MNA malees, gosoota seelii adda addaa ascites fi tumors keessatti, meetaabolayitoonni biroo TIL keessatti amala gaarii hin qabnes adda addaan badhaadha (Fakkii S3 fi S4). Kanaafuu, odeeffannoon kun qorannoo dabalataaf tuuta meetaabolayitoota immunomodulatory abdachiisaa ta’e mul’isa.
(A) Qabiyyee MNA idilee ta’e seelii CD4+, CD8+ fi CD45- ascites fi tumoor irraa. Plootiin saanduqa gidduugaleessa (sarara), hanga interkuartaayilii (frame hinnge) fi hamma deetaa agarsiisa, hanga dachaa 1.5 interquartile range (frame whisker). Akkuma Meeshaalee fi Mala Dhukkubsataa keessatti ibsametti, gatii limma dhukkubsataa fayyadamuun gatii P murteessuu (*P<0.05 fi **P<0.01). (B) Diyaagirama iskiimaatikii meetaabolii MNA (60). Meetaabolaayitoota: S-adeenoosiil-1-meetiyooniin; SAH, S-adenoosiin-1-hoomoosiistaayinii; NA, nikootinaamaayidii; MNA, 1-metiilnikootinaamaayidii; 2-PY, 1-metiil- 2-piriidoon-5-kaarboksaayidii; 4-PY, 1-metiil-4-piriidoon-5-kaarboksaayidii; NR, nikootinaamaayidii raayboosii; NMN, nikootinaamaayidii monoonuukiliyootaayidii. Inzaayimoota (magariisa): NNMT, nikootinaamaayidii N-metiiltiraansifeereezii; SIRT, sirtuins jedhaman; NAMPT, nikootinaamaayidii fosforiiboosiil tiraansifereezii; AOX1, aldeehaydii oksaayidii 1; NRK, nikootinaamaayidii raayboosaayidii kinaasii; NMNAT, nikootinaamaayidii monoo Niwuukilootaayidii adeeniileetii tiraansifereesii; Pnp1, piyuuriin niwuukiloosaayidii fosfooraayileezii. (C) t-SNE kan scRNA-seq kan ascites (grey) fi tumoor (diimaa; n = dhukkubsattoota 3). (D) NNMT ibsa uummata seelii adda addaa scRNA-seq fayyadamuun adda baafame keessatti. (E) Ibsa NNMT fi AOX1 SK-OV-3, tiruu miciree namaa (HEK) 293T, seelii T fi seelii T MNAn wal’aanamanii keessatti. Ibsi dachaafame SK-OV-3 wajjin walqabatee agarsiifama. Akkaataan ibsa SEM waliin agarsiifameera (n = 6 arjoomtoota fayyaa). Gatiin Ct 35 ol ta’e akka waan hin argamneetti (UD) fudhatama. (F) Ibsa SLC22A1 fi SLC22A2 SK-OV-3, HEK293T, seelii T fi seelota T 8mM MNAn wal’aanamanii keessatti. Ibsi dachaafame SK-OV-3 wajjin walqabatee agarsiifama. Akkaataan ibsa SEM waliin agarsiifameera (n = 6 arjoomtoota fayyaa). Gatiin Ct 35 ol ta’e akka waan hin argamneetti (UD) fudhatama. (G) Qabiyyee MNA seelii seelii T arjooma fayyaa hojiirra oole keessatti sa’aatii 72 MNA waliin erga inkuubeshinii booda. Akkaataan ibsa SEM waliin agarsiifameera (n = 4 arjoomtoota fayyaa).
MNAn kan uumamu garee meetiilii S-adenosyl-1-methionine (SAM) irraa gara nicotinamide (NA)tti nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Fakkii 3B) tiin dabarsuudhaani. NNMT kaansarii namaa adda addaa keessatti garmalee kan ibsamu yoo ta’u, baay’ina, weerara fi meetaastaasii wajjin walqabatee jira (25-27). Madda MNA seelii T TME keessatti caalaatti hubachuuf, nuyi scRNA-seq fayyadamne ibsa NNMT gosoota seelii hunda ascites fi tumoors dhukkubsattoota HGSC sadii keessatti amala (Gabatee S5). Xiinxalli tilmaamaan seelii 6,500 akka agarsiisutti naannoo ascites fi tumoor keessatti, ibsi NNMT baay'ina fibroblast fi tumor seelii tilmaamame irratti daangeffameera (Fakkii 3, C fi D). Uummata kamiyyuu keessatti ibsi NNMT ifa ta’e kan PTPRC (CD45 +) ibsu akka hin jirre hubatamuu qaba (Fakkii 3D fi Fakkii S5A), kunis MNA ispeektarmii meetaabolayitii keessatti argame seelii T keessatti akka galfame agarsiisa. Ibsi aldeehaydii oksaayidii 1 (AOX1) MNA gara 1-metiil-2-piriidoon-5-kaarboksaayidii (2-PYR) ykn 1-metiil-4-piriidoon-5-kaarboksaayidii (4- PYR)tti jijjiira; Fakkiin 3B) akkasumas baay’ina fibroblasts COL1A1 ibsan irratti kan daangeffame dha (Fakkii S5A), kunis walitti makamuun seelonni T dandeettii meetaabolii MNA barame akka hin qabne agarsiisu. Akkaataan ibsa jiiniiwwan MNA-walqabatan kanaa dhukkubsattoota HGSC irraa ascites irraa tuuta daataa seelii of danda'e lammaffaa fayyadamuun mirkanaa'e (Fakkii S5B; n = 6) (16). Dabalataanis, xiinxalli quantitative polymerase chain reaction (qPCR) seelota T arjooma fayyaa MNAn wal’aanamanii akka agarsiisutti, seelii to’annoo SK-OV-3 ovarian tumor seelii wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu, NNMT ykn AOX1 almost not exped (Fakkii 3E). Bu’aawwan hin eegamne kunniin MNAn fibroblasts ykn tumors irraa gara seelii T itti aananii jiran TME keessatti dhokfamuu akka danda’u agarsiisu.
Kaadhimamaa maatii geejjibaa kaatiyoon orgaanikii 1 hanga 3 (OCT1, OCT2 fi OCT3) maatii geejjiba bulbulamaa 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 fi SLC22A3) tiin koodii ta'e kan hammatu ta'us, geejjiboonni MNA ta'uu danda'an ammallee hin ibsamne (28) . QPCR mRNA seelii T arjooma fayyaa irraa sadarkaa ibsa SLC22A1 gadi aanaa agarsiise garuu sadarkaa SLC22A2 hin adda baafamne agarsiise, kunis kanaan dura barreeffamoota keessatti akka gabaafame mirkaneesse (Fakkii 3F) (29). Faallaa kanaatiin, sararri seelii dhiigaa ovaarii SK-OV-3 geejjiba lamaan sadarkaa olaanaa ibseera (Fakkii 3F).
Seelonni T dandeettii MNA biyya alaa xuuxuu qabaachuu isaanii qorachuuf, seelonni T arjoomtoota fayyaa ta’an bakka qindoominni MNA adda addaa jirutti sa’aatii 72f aadaa godhamaniiru. MNAn alaa yoo hin jiraanne qabiyyeen seelii MNA adda baafamuu hin danda’u (Fakkii 3G). Haa ta'u malee, seelonni T activated MNA exogenous wal'aanamanii qabiyyee MNA seelii keessatti doosiin irratti hundaa'e dabaluu agarsiisan, hanga 6 mM MNA (Fakkii 3G). Bu’aan kun sadarkaan ibsa geejjibaa gadi aanaa ta’ee fi inzaayimii ijoo meetaabolii MNA seelii keessaaf itti gaafatamummaa qabu dhabuus, TIL ammallee MNA fudhachuu akka danda’u agarsiisa.
Ispeektariin meetaabolayitoota seelii T dhukkubsattootaa fi yaalii xuuxuu MNA in vitro keessatti taasifamu carraa fibroblasts kaansarii wajjin walqabatan (CAF) MNA dhoksuu fi seelonni tumoor fenotype fi dalagaa TIL to’achuu danda’u ni dabala. Dhiibbaa MNA seelii T irratti qabu murteessuuf, seelonni T arjoomtoota fayyaa ta’an bakka MNA jirutti ykn hin jirretti in vitro keessatti kan socho’an yoo ta’u, baay’ina isaanii fi oomishni saayitookinii madaalameera. MNA doosiin ol’aanaa ta’een guyyoota 7 erga itti dabalamee booda, lakkoofsi baay’ina ummataa dachaa ta’e giddu galeessaan kan hir’ate yoo ta’u, ciminni ammoo doosiiwwan hunda irratti eegameera (Fakkii 4A). Dabalataanis, wal’aansi MNA alaa pirooppoorshinii seelii CD4 + fi CD8 + T tumor necrosis factor-α (TNFα; Fakkii 4B) ibsan dabaluu fideera. Faallaa kanaatiin, oomishni seelii keessaa IFN-γ seelii CD4 + T keessatti haalaan hir’ateera, garuu seelii CD8 + T keessatti hin hir’anne, akkasumas interliyuukiin 2 keessatti jijjiiramni guddaan hin argamne (IL-2; Fakkii 4, C fi D). Kanaafuu, qorannoon inzaayimii-walqabsiifame immunosorbent (ELISA) supernatants aadaa T seelii MNA-wal'aanamaa kana irraa TNFα guddaa dabaluu, IFN-γ hir'achuu, fi jijjiirama IL-2 agarsiise (Fakkii 4, E hanga G). . Hir’inni IFN-γ MNA sochii farra tumoor seelii T dhorkuu keessatti gahee qabaachuu akka danda’u agarsiisa. Dhiibbaa MNAn saayitootoksiisitii seelii T gidduu galeessa godhate irratti qabu fakkeessuuf, seelonni antijeen fudhataa kiimeerikii T (FRα-CAR-T) kanneen seelii fudhataa fooleetii α fi CAR-T (GFP) irratti xiyyeeffatan kanneen pirootiinii magariisa fluorescent (GFP) -CAR-T)n to’ataman seelota dhiiga mononuclear dhiiga naannoo arjooma fayyaa ta’aniin (PBMC) oomishamu. Seelonni CAR-T sa’aatii 24f bakka MNA jirutti aadaa godhaman, achiis seelonni tumoor ovaarii namaa SK-OV-3 kanneen folate receptor α ibsan waliin reeshiyoo effector fi target 10:1 irratti waliin guddatan. Wal'aansi MNA sochii ajjeechaa seelii FRα-CAR-T irratti hir'ina guddaa kan fide yoo ta'u, kunis seelii FRα-CAR-T adenosine'n wal'aanamanii wajjin wal fakkaata (Fakkii 4H).
(A) Lakkoofsa seelii jiraachuu danda’u waliigalaa fi dachaa baay’ina ummataa (PD) kallattiin aadaa irraa guyyaa 7. Giraafiin bar giddugaleessa + SEM arjoomtoota fayyaa ja’a bakka bu’a. Yoo xiqqaate n = 3 yaalii of danda’e irraa daataa bakka bu’a. (B hanga D) CD3/CD28 fi IL-2 seelii T qindoomina MNA isaanii irratti guyyoota 7f hojiitti galchuuf itti fayyadamaniiru. Xiinxala dura seelonni PMA/ionomycin GolgiStop waliin sa'aatii 4f kakaafamaniiru. TNFα (B) ibsamuu seelii T keessatti. Fakkeenya fakkii (bitaa) fi daataa gabatee (mirga) ibsa TNFα seelii lubbuu qabu keessatti. IFN-γ (C) fi IL-2 (D) seelii T keessatti ibsamuu. Ibsi saayitookiinii dhangala’aa saayitoomeetiriitiin safarame. Giraafiin bar giddugaleessa (n = arjoomtoota fayyaa 6) + SEM bakka bu’a. Gatii P murteessuuf xiinxala karaa tokkoo kan jijjiiramaafi safartuuwwan irra deddeebi’aman (*P<0.05 fi **P<0.01) fayyadamuu. Yoo xiqqaate n = 3 yaalii of danda’e irraa daataa bakka bu’a. (E hanga G) CD3/CD28 fi IL-2 seelii T qindoomina MNA isaanii irratti guyyoota 7f hojiitti galchuuf itti fayyadamaniiru. Meediyaan kun PMA/ionomycin stimulation sa’aatii 4 duraa fi booda walitti qabame. Xiyyeeffannaan TNFα (E), IFN-γ (F) fi IL-2 (G) ELISAn safarameera. Giraafiin bar giddugaleessa (n = arjoomtoota fayyaa 5) + SEM bakka bu’a. Gatiin P xiinxala karaa tokkoon jijjiiramaafi safartuu irra deddeebi’amee fayyadamuun murtaa’e (*P<0.05). Sararri tuqaa daangaa adda baasuu adda baasuu agarsiisa. (H) Qorannoon seelii lysis. Seelonni FRα-CAR-T ykn GFP-CAR-T adenosine (250μM) ykn MNA (10 mM) waliin sa'aatii 24f sirreeffaman, ykn osoo hin yaalamin hafe (Ctrl). Ajjeechaan dhibbeentaa seelii SK-OV-3 safarameera. Gatiin P qorannoo Welch t tiin murtaa’e (*P<0.5 fi **P<0.01).
Hubannoo malaa MNA-hirkataa TNFα ibsa dambii argachuuf, jijjiiramni TNFα mRNA seelii T MNA-wal'aanamaa madaalameera (Fakkii 5A). Seelonni T arjoomtoota fayyaa ta’an MNAn wal’aanamanii sadarkaa tiraanskriipshinii TNFα dachaa lama dabaluu agarsiisan, kunis MNA dambii tiraanskriipshinii TNFα irratti hirkataa ta’uu agarsiisa. Mala dambii ta'uu danda'u kana qorachuuf, sababoonni tiraanskriipshinii beekamoo lama TNFα to'atan, jechuunis activated T cell nuclear factor (NFAT) fi pirootiinii addaa 1 (Sp1), deebii MNA hidhachuu proximal TNFα promoter ( 30) madaalameera. Piroomootarri TNFα bakka NFAT hidhuu adda baafame 6 fi iddoowwan hidhuu Sp1 2 kan of keessaa qabu yoo ta'u, bakka tokkotti wal-irra bu'a [-55 base pairs (bp) from the 5'cap] (30). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) akka agarsiisutti MNAn yeroo wal’aanamu, hidhamuun Sp1 piroomootara TNFαtti dachaa sadii akka dabalu agarsiise. Inkorporeeshiniin NFATs dabalee barbaachisummaa isaatti dhiyaate (Fakkii 5B). Daataan kun MNA ibsa TNFα karaa Sp1 tiraanskriipshinii, fi hamma xiqqaa ta'een ibsa NFAT akka to'atu agarsiisu.
(A) Seelota T MNA malee aadaa ta’anii wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu, jijjiiramni dachaa ibsa TNFα seelii T MNAn wal’aanamanii keessatti. Akkaataan ibsa SEM waliin agarsiifameera (n = 5 arjoomtoota fayyaa). Yoo xiqqaate n = 3 yaalii of danda’e irraa daataa bakka bu’a. (B) TNFα piroomootarri seelota T NFAT fi Sp1 booda 8 mM MNAn ykn osoo hin qabaatin wal’aanamanii (Ctrl) fi PMA/ionomycin kaka’umsa waliin sa’aatii 4f walitti makamaniiru. Immunoglobulin G (IgG) fi H3 akka to’annoo negaatiivii fi pozaatiiviitti immunoprecipitation, akkaataa wal duraa duubaan fayyadamaniiru. Lakkoofsi ChIP seelota MNAn wal’aanamanii keessatti hidhuun Sp1 fi NFAT piroomootara TNFαtti to’annoo wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu dachaa hedduu akka dabale agarsiise. Yoo xiqqaate n = 3 yaalii of danda’e irraa daataa bakka bu’a. Gatiin P qorannoo t-dachaadhaan murtaa’e (*** P <0.01). (C) Ascites HGSC wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu, seelonni T (non-cytotoxic) ibsa TNF tumor keessatti dabaluu agarsiisan. Halluuwwan dhukkubsattoota adda addaa bakka bu’u. Seelonni agarsiifaman akka tasaa gara 300tti saamuda fudhatamee fi jittered ta'ee garmalee harkisuu daangeessuuf (** Padj = 0.0076). (D) Moodeela MNA kaansarii ovaariif yaadame. MNAn seelii tumoor fi fibroblasts TME keessatti kan uumamu yoo ta’u seelii T tiin fudhatama. MNAn hidhata Sp1 gara piroomootara TNFαtti dabala, kunis TNFα tiraanskriipshinii fi oomisha saayitookinii TNFα akka dabalu taasisa. MNAnis IFN-γ akka hir’atu taasisa. Hojii seelii T dhorkuun dandeettii ajjeesuu hir’isuu fi guddina tumoor saffisiisa.
Akka gabaasaaleen jedhanitti, TNFα bu’aa farra tumoor fi farra tumoor fuulduraa fi duubaa irratti hundaa’e qaba, garuu guddinaa fi meetaastaasii kaansarii ovaarii guddisuu keessatti gahee beekamaa qaba (31-33). Akka gabaasaaleen mul’isutti, dhukkubsattoota kaansarii ovaarii qaban keessatti tishuuwwan ascites fi tumoor keessatti TNFα kan tishuuwwan gaarii ta’an caalaa ol’aanaadha (34-36). Gama malaatiin, TNFα activation, function fi proliferation seelii dhiiga adii to'achuu, fi phenotype seelii kaansarii jijjiiruu danda'a (37, 38). Argannoowwan kanaan kan walsimu, xiinxalli ibsa jiinii adda addaa TNF seelii T tishuuwwan tumoor keessatti ascites wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu baay'ee ol-regulated akka ture agarsiise (Fakkii 5C). Dabalaan ibsa TNF uummata seelii T fenootayipii saayitootoksiikii hin taane qaban qofa keessatti mul’ateera (Fakkii S5A). Walumaagalatti, odeeffannoon kunniin ilaalcha MNA HGSC keessatti bu’aa immunosuppressive fi tumor promoting lama qaba jedhu deeggaru.
Asxaa fluorescent kan flow cytometry irratti hundaa’e mala ijoo meetaabolii TIL qorachuuf ta’eera. Qorannoowwan kunniin akka agarsiisanitti, limfoosaayitii dhiiga naannoo ykn seelonni T qaamolee limfooyidii sadarkaa lammaffaa irraa dhufan waliin walbira qabamee yoo ilaalamu, TIL hantuutaa fi namaa gilukoosii fudhachuuf (4, 39) fi dalagaa maaytookondriyaa suuta suutaan dhabuu (19, 40) akka qaban agarsiisaniiru. Qorannoon kun bu’aa walfakkaataa arginus, guddinni ijoo meetaabolii seelii tumoor fi TIL tishuuwwan tumoor walfakkaataa irraa ciccirame irraa walbira qabuudha. Gabaasawwan kanaan duraa tokko tokko waliin kan walsimu, seelonni tumoor (CD45-EpCAM +) ascites fi tumoor irraa dhufan seelii CD8 + fi CD4 + T caalaa fudhatama gilukoosii olaanaa kan qaban yoo ta’u, kunis fudhatamni gilukoosii olaanaa seelota tumoor seelii T waliin wal bira qabamee ilaalamuu akka danda’u deeggara. Yaad-rimee dorgommii seelii T. TME. Haa ta’u malee, sochiin maaytookondriyaa seelota tumoor kan seelii CD8 + T caalaa ol’aanaa yoo ta’u, sochiin maaytookondriyaa garuu kan seelii CD4 + T wajjin walfakkaata. Bu’aan kun mata duree mul’achaa jiru kan meetaaboliizimiin oksijiinii seelii tumoor barbaachisaa ta’e jedhu cimsu ( 41 , 42 ). Akkasumas seelonni CD8 + T seelonni CD4 + T caalaa hojii oksijiinii hojjechuuf saaxilamoo ta’uu akka danda’an, ykn seelonni CD4 + T sochii maaytookondriyaa eeguuf madda kaarboonii gilukoosii malee fayyadamuu akka danda’an yaada (43, 44). Garaagarummaan fudhatama gilukoosii ykn sochii maaytookondriyaa CD4 + T effectors, T effector memory fi T central memory cells gidduutti ascites keessatti akka hin argine hubatamuu qaba. Haaluma walfakkaatuun, haalli addaan baafamuu seelii CD8 + T tumoor keessatti jijjiirama fudhatama gilukoosii wajjin waan wal qabatu hin qabu, garaagarummaa guddaa seelota T in vitro aadaa fi TIL namaa in vivo gidduu jiru calaqqisiisa ( 22 ). Tajaajilli kunniin ramaddii baay’ina seelii ofumaan loogii hin qabne fayyadamuudhaanis kan mirkanaa’e yoo ta’u, kunis daran seelonni CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + kanneen seelota tumoor caalaa fudhatama gilukoosii fi sochii maaytookondriyaa olaanaa qaban baay’inaan kan argaman ta’us baay’ina seelii sochii Metabolic kan qaban ta’uu isaanii caalaatti mul’ise. Uummanni kun uummata xiqqaa tilmaamame seelota ukkaamsaa maayilooyidii ykn seelota pilaasmasaayitooyidii deendriitii xiinxala scRNA-seq keessatti adda baafaman bakka bu’uu danda’a. Isaan kun lamaan dhibee ovaarii namaa keessatti kan gabaafaman ta’us [45], ammallee isaan barbaachisa Hojiin dabalataa subpopulation maayilooyidii kana ibsuudha.
Malli dhangala’aa saayitoomeetirii irratti hundaa’e garaagarummaa waliigalaa meetaabolii gilukoosii fi oksijiinii gosoota seelii gidduu jiru qulqulleessuu kan danda’u ta’us, meetaabolayitoonni sirrii gilukoosii ykn maddoota kaarboonii birootiin meetaabolii maaytookondriyaa TME keessatti oomishaman ammallee hin murtoofne. Argamuu fi dhabamuu meetaabolayitoota tuuta xiqqaa TIL kennameef ramaduun baay’ina seelii tishuu ciccirame irraa qulqulleessuu barbaada. Kanaafuu, mala badhaadhina seelii keenyaa mass spectrometry waliin walitti makame meetaabolayitoota seelii T fi uummata seelii tumoor keessatti garaagarummaadhaan badhaadhan saamuda dhukkubsataa walsimsiisu keessatti hubannoo kennuu danda'a. Malli kun sassaabbii seelii fluorescence-activated irratti faayidaa qabaatus, manneen kitaabaa meetaabolayitii murtaa'an sababa tasgabbii uumamaan jiruu fi/ykn saffisa jijjiirraa saffisaatiin dhiibbaa irra gahuu danda'u (22). Kanas ta’e sana, malan keenya gosoota saamuda gidduutti garaagarummaa guddaa waan qabaniif, meetaabolayitoota immunosuppressive beekamtii qaban lama, adenosine fi kynurenine adda baasuu danda’eera.
Xiinxalli meetaabonoomii keenya kan tumoor fi gosoota xiqqaa TIL gahee meetaabolayitoota TME ovaarii keessatti qaban irratti hubannoo dabalataa kenna. Tokkoffaa, flow cytometry fayyadamuun, garaagarummaan sochii mitochondrial tumors fi CD4 + T cells gidduutti akka hin jirre murteessine. Haa ta’u malee, xiinxalli LC-MS/MS baay’ina meetaabolayitoota uummata kana gidduutti jijjiirama guddaa kan mul’ise yoo ta’u, kunis xumurri waa’ee meetaabolii TIL fi sochii meetaabolii waliigalaa isaa of eeggannoodhaan hiikamuu akka barbaadu agarsiisa. Lammaffaa, MNAn meetaabolayitii garaagarummaa guddaa CD45-seelii fi T seelii ascites keessatti qabu malee tumoor miti. Kanaafuu, compartmentalization fi bakki tumoor meetaabolii TIL irratti dhiibbaa adda addaa qabaachuu danda'a, kunis naannoo maaykiroo kenname keessatti heterogeneity ta'uu danda'u calaqqisiisa. Sadaffaa, ibsi inzaayimii MNA oomishu NNMT irra caalaa CAF irratti kan daangeffame yoo ta’u, kunis hamma xiqqaadhaan seelii tumoor yoo ta’u, sadarkaan MNA adda baafamuu danda’u garuu seelii T tumoor irraa argame keessatti ni mul’ata. Garmalee ibsamuu NNMT CAF ovaarii keessatti bu'aa kaansarii guddisuu beekamaa qaba, gartokkoon sababa guddina meetaabolii CAF, weerara tumoor fi meetaastaasii ( 27 ). Sadarkaan waliigalaa TIL giddu galeessa ta’us, ibsi NNMT CAF keessatti gosa xiqqaa mesenchymal Atlas Jiinoomii Kaansarii (TCGA) waliin walitti dhiyeenyaan kan walqabatu yoo ta’u, kunis raajii gadhee wajjin walqabatee jira ( 27 , 46 , 47 ). Dhumarratti, ibsi inzaayimii AOX1 MNA diigamuuf itti gaafatamummaa qabuus uummata CAF qofa irratti kan daangeffame yoo ta’u, kunis seelonni T dandeettii MNA meetaabolii gochuu akka hin qabne agarsiisa. Bu’aan kunniin argannoo kana mirkaneessuuf hojiin dabalataa barbaachisaa ta’us, sadarkaan MNA ol’aanaan seelii T keessatti argamu naannoo maaykiroo CAF immunosuppressive jiraachuu agarsiisuu danda’a jedhu deeggaru.
Sadarkaan ibsa geejjibaa MNA gadi aanaa ta’uu fi sadarkaa pirootiinota ijoo meetaaboliizimii MNA keessatti hirmaatan adda baafamuu hin dandeenye yoo ilaalle, argamuun MNA seelii T keessatti waan hin eegamnedha. NNMTs ta’e AOX1 xiinxala scRNA-seq fi qPCR irratti xiyyeeffate garee of danda’e lamaatiin adda baafamuu hin dandeenye. Bu’aawwan kunniin MNA seelii Ttiin kan walnyaatamu osoo hin taane, TME naannoo isaa jiru irraa akka xuuxamu agarsiisu. Yaalii in vitro akka agarsiisutti seelonni T MNA exogenous kuufachuu barbaadu.
Qorannoon keenya in vitro akka agarsiisutti MNA exogenous ibsa TNFα seelii T keessatti kakaasuu fi hidhata Sp1 TNFα promoter guddisa. TNFα dalagaa farra tumoor fi farra tumoor qabaatus, kaansarii ovaarii keessatti TNFα guddina kaansarii ovaarii guddisuu danda’a (31-33). Aadaa seelii tumoor ovaarii keessatti TNFα neutralization ykn dhabamsiisuu mallattoo TNFα moodeelota hantuutaa keessatti TNFα-jiddugaleessa inflammatory cytokine oomisha fooyyessuu fi guddina tumoor dhorkuu danda'a ( 32 , 35 ). Kanaafuu, haala kana keessatti, TME-derived MNA akka pro-inflammatory metabolite karaa TNFα-hirkataa mala karaa autocrine loop hojjechuu danda'a, kanaanis uumamuu fi babal'ina kaansarii ovaarii guddisuu danda'a ( 31 ). Carraa kana irratti hundaa’uun, uggurri TNFα akka ergamaa wal’aansaa kaansarii ovaariif ta’uu danda’utti qoratamaa jira (37, 48, 49). Dabalataanis, MNAn saayitootoksiisitii seelonni CAR-T seelii tumoor ovaarii irratti kan miidhu yoo ta’u, kunis MNA-jiddugaleessa ta’een ukkaamsa ittisa qaamaa ragaa dabalataa kenna. Walumaagalatti, bu’aawwan kun moodeela kan seelonni tumoor fi CAF MNA gara TME seelii alaatti dhoksan agarsiisu. Karaa (i) TNF-induced guddina kaansarii ovaarii kakaasuu fi (ii) MNA-induced T cell cytotoxic activity inhibition, kun bu'aa tumoor lama qabaachuu danda'a (Fakkii 5D).
Xumura irratti, walnyaatinsa badhaadhina seelii saffisaa, tartiiba seelii tokkoo fi piroofaayilii meetaabolii hojiirra oolchuudhaan, qorannoon kun garaagarummaa guddaa immunometabolomic seelii tumoor fi ascites gidduu jiru dhukkubsattoota HGSC keessatti mul'ise. Xiinxalli bal’aan kun garaagarummaan fudhatama gilukoosii fi sochii maaytookondriyaa seelii T gidduutti akka jiru agarsiise, akkasumas MNA akka meetaabolayitii to’annoo ittisa qaamaa of danda’ee seelii hin taaneetti adda baaseera. Daataan kun akkaataa TMEn meetaabolii seelii T kaansarii namaa keessatti dhiibbaa geessisu irratti dhiibbaa qaba. Dorgommiin kallattiin soorataa seelii T fi seelii kaansarii gidduutti taasifamu gabaafamuus, meetaabolayitoonni akka to’attoota al-kallattiittis ta’uun guddina tumoor guddisuu fi deebii ittisa qaamaa keessaa ukkaamsuu danda’u. Ibsi dabalataa gahee hojii meetaabolayitoota qajeelfama kanaa deebii ittisa farra tumoor guddisuuf tooftaalee filannoo banuu danda’a.
Saamuda dhukkubsattootaa fi odeeffannoon kilinikaa karaa kuusaa tishuuwwan kaansarii BC kan Neetwork Kuusaa Tishuu Kanaadaatiin mirkanaa’een argameera. Akka pirootokoolii koree naamusa qorannoo kaansarii BC fi Yuunivarsiitii Biritish Kolumbiyaa (H07-00463)n mirkanaa’etti, saamuda dhukkubsattootaa fi ragaan kilinikaa hundi hayyama barreeffamaa odeeffannoo qabu argatan ykn hayyama isaanii sirnaan dhiisaniiru. Saamudaaleen kunniin BaayooBaankii mirkanaa’e (BRC-00290) keessatti kuufamaniiru. Amaloonni dhukkubsataa bal’aan gabatee S1 fi S5 irratti agarsiifamaniiru. Crayopreservation'f, scalpel fayyadamuun saamuda tumoor dhukkubsataa makaanikaalatti diiguudhaan, sana booda filter 100-micron keessa dhiibuun seelii tokko suspension argachuuf gargaara. Ascites dhukkubsataa 1500 rpm daqiiqaa 10f 4°C irratti centrifuged seelota pellet fi supernatant balleessuuf. Seelonni tumoor fi ascites irraa argaman seerumi AB namaa %50 ho’aan hin sochoone (Sigma-Aldrich), %40 RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) fi %10 dimethyl sulfoxide keessatti cryopreserved ta’aniiru. Suspensions seelii tokkoo kunuunfame kunniin kan qabbanaa’anii fi meetabolomiksii fi murtee meetaabolayitii armaan gaditti ibsameef itti fayyadamaniiru.
Giddugaleessi guutuun 0.22 μm calalamee 50:50 dabalataan RPMI 1640: AimV of keessaa qaba. RPMI 1640 + 2.05 mM l-gilutaamiinii (Thermo Fisher Scientific) kan seerumi AB namaa %10 ho’aan hin sochoone (Sigma-Aldrich), Hepes 12.5 mM (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Peenisiiliinii Istiriiptoomaayisin (PenStrep) furmaata (Thermo Fisher Scientific) fi 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) Hepes 20 mM (Thermo Fisher Scientific) fi l-glutamine 2 mM (Thermo Fisher Scientific) waliin dabalameera. Baafarri faaluu saayitoomeetira yaa’aa 0.22μm calalamee fosfeetii baafaara soogidda (PBS; Invitrogen) kan seerumi namaa AB %3 ho’aan hin sochoone (Sigma) dabalame of keessaa qaba. Baafarri badhaadhina seelii PBS 0.22μm calalame irraa kan ijaarame yoo ta’u, seerumi AB namaa %0.5 ho’aan hin sochoone (Sigma-Aldrich) dabalameera.
Giddugaleessa guutuu 37°C keessatti seelonni 10 nM MT DR fi 100 μM 2-NBDG daqiiqaa 30f faalamanii turan. Itti aansuudhaan seelonni daayii jireenyaa eF506 4°C irratti daqiiqaa 15f faalamanii turan. Seelonni FC Block (eBioscience) fi Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) keessatti deebi’anii dhaabuu, flow cytometer staining buffer keessatti dilute gochuu (akka qajeelfama oomishtootaatti), fi daqiiqaa 10f ho’a kutaa keessatti inkuubeer gochuu. Seelii tuuta farra qaamaatiin (Gabatee S2) baafaara faaluu yaa’aa saayitoomeetirii keessatti 4°C irratti daqiiqaa 20f faaluu. Seelii xiinxala dura baafaara faaluu saayitoomeetirii yaa’aa (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) keessatti deebi’anii dhaabuu. Deetaa lakkoofsa man'ee xiinxaluuf SpectroFlo fi FlowJo V10 fayyadami, fi deetaa uumuuf GraphPad Prism 8 fayyadami. Giddugaleessi cimina fluorescence (MFI) 2-NBDG fi MT DR log-normalized ture, sana booda dhukkubsattoota walsimsiisan herrega gochuuf xiinxala istaatiksiidhaaf qorannoon t lama lama fayyadameera. Uummata taateewwan 40 gadi qaban hunda xiinxala keessaa baasuu; xiinxala istaatiksii fi mul’ata deetaa raawwachuu dura gatiiwwan negaatiivii kamiifuu gatii MFI 1 galchi.
Tooftaa gating harkaan hojjetamu kan paanaalii adeemsa armaan olii dabaluudhaaf, FlowJo keessatti seelii du'e erga dhabamsiifnee booda ofumaan seelii uummataaf ramaduuf muka daangeffama boca (FAUST) (21) tiin yaadannoo guutuu fayyadamne. Nu harkaan oomisha bulchine uummata misallocated fakkaatu (PD1 + seelii PD1-tumor waliin walitti makuu) fi uummata qabame walitti makuu. Tokkoon tokkoon saamudaa giddu galeessaan seelii %2 ol kan of keessaa qabu yoo ta’u, walumaa galatti uummata 11 qaba.
PBMC oomishaalee adda baasuu liyuukoosaayitii (STEMCELL Technologies) irraa adda baasuuf ficoll gradient density centrifugation fayyadameera. Seelonni CD8 + T CD8 MicroBeads (Miltenyi) fayyadamuun PBMC irraa adda baafamanii akkaataa qajeelfama oomishtootaatiin TransAct (Miltenyi) fayyadamuun meediyaa guutuu keessatti torban 2f babal’ifamaniiru. Seelonni meediyaa guutuu IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) of keessaa qabu keessatti guyyoota 5f akka dhaabbatan hayyamameef, sana booda TransAct tiin irra deebi’anii kakaafaman. Guyyaa 7ffaatti akka qajeelfama oomishtootaatti, CD45 MicroBeads (Miltenyi) namaa marsaa sadii walitti aansuun seelii badhaadhessuuf itti fayyadamaniiru. Seelonni xiinxala saayitoomeetirii yaa’aa (akkuma armaan olitti ibsametti) kan qoodaman yoo ta’u, seelonni miliyoona tokko xiinxala LC-MS/MS tiif yeroo sadii qoodamaniiru. Saamudaaleen akka armaan gaditti ibsametti LC-MS/MSn kan hojjetamanidha. Gatii meetaabolayitii dhabame lakkoofsa ayoon 1,000 waliin tilmaamne. Tokkoon tokkoon saamudaa lakkoofsa ayoon waliigalaa (TIC) tiin normalize ta’a, loogaritmiidhaan jijjiiramee xiinxala dura MetaboAnalystR keessatti ofumaan normalize ta’a.
Suspension seelii tokkicha tokkoon tokkoon dhukkubsataa qabbanaa’ee filtara 40 μm keessaa gara meediyaa guutuutti (akkuma armaan olitti ibsametti) calalame. Akka pirootokoolii oomishtootaatti, saamuda seelii CD8+, CD4+ fi CD45- (ice irratti) badhaadhessuuf MicroBeads (Miltenyi) fayyadamuun marsaa sadii walitti aansuun filannoo pozaatiivii maagneetii biid addaan baasuun fayyadamaniiru. Gabaabumatti, seelonni baafaara badhaadhina seelii keessatti (akkuma armaan olitti ibsametti) deebi’anii suspended ta’anii lakkaa’amu. Seelonni CD8 beads namaa, CD4 beads namaa ykn CD45 beads namaa (Miltenyi) waliin 4°C irratti daqiiqaa 15f inkuubeer ta’anii, sana booda seelii badhaadhina buffer tiin dhiqamaniiru. Saamuda tarree LS (Miltenyi) keessa darba, firaakshiniin pozaatiivii fi negaatiivii walitti qabama. Turtii hir’isuu fi tarkaanfii fayyina seelii guddisuuf, sana booda CD8-firaakshiniin marsaa lammaffaa CD4+ badhaadhinaaf kan oolu yoo ta’u, CD4-firaakshiniin ammoo CD45-badhaadhina itti aanuuf oola. Adeemsa addaan baasuu hunda keessatti furmaata sana bubbee irratti kaa’i.
Saamuda xiinxala meetaabolayitii qopheessuuf, seelonni al tokko furmaata soogidda qabbanaa’aa akka cabbiitiin dhiqamaniiru, tokkoon tokkoon saamudaatti meetaanoolii %80 1 ml itti dabalame, sana booda vortexed fi snap frozen naayitiroojiinii dhangala’aa keessatti. Saamudaaleen marsaa qorraan-dhawwii sadii kan raawwataman yoo ta’u, daqiiqaa 15f 4°C irratti 14,000 rpm irratti seentirifuugii taasifamaniiru. Supernatant meetaabolayitoota of keessaa qabu hanga gogutti danfifama. Meetaabolayitoonni asiidii foormii 0.03% 50 μl keessatti irra deebi’anii bulbulamaniiru, vortexed ta’anii akka makaman, achiis seentirifuugii ta’anii caccabaa balleessaniiru.
Meetaabolayitoota akka armaan olitti ibsametti baasuu. Qorannoo meetaaboloomiksiif supparnaataantii gara qaruuraa dhangala’aa kiroomaatoogiraafii ga’umsa olaanaa qabutti dabarsuu. Tokkoon tokkoon saamuda lakkoofsa walfakkaataa seelii wal’aanuun bu’aa batch ittisuuf pirootokoolii wal’aansa tasaa fayyadamuu. Madaallii qulqullinaa meetaabolayitoota addunyaa kanaan dura AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) irratti maxxanfaman raawwanne. Xiinxalli kiroomaatoogiraafii fi walitti makamuun naannoo olka’aa sooftiweeri MultiQuant version 2.1 (Applied Biosystems SCIEX) fayyadamuun raawwatameera.
Gatii meetaabolayitii dhabame tilmaamuuf lakkoofsi ayoon 1000 kan fayyadame yoo ta’u, TICn tokkoon tokkoon saamudaa naannoo olka’iinsa idilee ta’e meetaabolayitii adda baafame tokkoon tokkoon isaa shallaguuf jijjiirama xiinxala meeshaa adeemsa saamudaa irraa dhufe sirreessuuf itti fayyadameera. TIC erga normalize ta'ee booda, MetaboAnalystR(51) (parameter durtii) jijjiirraa loogaritmii fi iskeelii sarara noormii ofumaan fayyadama. Garaagarummaa meetaaboloomii gosoota saamuda gidduu jiru xiinxala qorannoo raawwachuuf PCA paakeejii vegan R waliin fayyadamne, dhukkubsattoota xiinxaluuf ammoo xiinxala gartokkee hir'ina fayyadamne. Fageenya Yuukiliidii saamuda gidduu jiru walitti qabuuf deendroogiraamii kaartaa ho’aa ijaaruuf mala Ward fayyadami. Nu limma (52) baay'ina meetaabolayitii sadarkaa isaa eeggate irratti fayyadamnee meetaabolayitoota garaagarummaa baay'ee guutummaa gosa seelii fi naannoo maaykiroo keessatti adda baasuuf. Ibsa salphisuuf, moodeela ifteessuuf paarameetira giddugaleessa garee fayyadamna, akkasumas gosoota seelii naannoo maaykiroo keessatti argaman akka garee tokkoon tokkootti ilaalla (n = gareewwan 6); qormaata hiikaaf, tokkoon tokkoon meetaabolayitiidhaaf safartuu irra deddeebi’amee sadii raawwanne Fakkaata sobaa akka hin uumamneef dhukkubsataan dizaayinii limmaa keessatti akka gufuutti hammatameera. Garaagarummaa meetaabolayitoota dhukkubsattoota adda addaa gidduu jiru sakatta’uuf, dhukkubsattoota dabalatee moodeela limmaa haala dhaabbataa ta’een sirreessine. Barbaachisummaa walfaallaa dursee ibsame gosa seelii fi naannoo maaykiroo Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg correction) gidduu jiru gabaasna.
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability) fayyadamuun erga cimina badhaadhina booda, tartiiba tiraanskriiptoomii seelii tokkoo waliigala ascites fi saamuda tumoor lubbuu qabbaneessuu irratti 10x 5′gene expression protocol fayyadamuun raawwatameera. Saamuda tumoor tokko irraa lubbuun jiraachuun isaa gadi aanaa ta’us akka hin hammatamne kan dhorke ta’us, dhimmoota shan kanneen tumoor fi ascites walsimsiisan qaban xiinxalamaniiru. Filannoo dhukkubsattootaa dachaa galmaan ga'uuf, saamuda dhukkubsataa tokkoon tokkoon isaanii daandii too'ataa kiroomiyeemii 10x keessatti walitti qabnee, iddoowwan ascites fi tumoor addaan xiinxalle. Erga tartiiba [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp dhuma lamaan (PE), jiinoomii Kuubeek; giddu galeessaan seelii tokkoof dubbisa 73,488 fi 41,378 akkaataa walduraa duubaan tumoor fi ascites]], nuti CellSNP fi Vireo (53) fayyadamne (CelSNP irratti hundaa'uun akka The common human SNP (VCF) provided by GRCh38 is assigned a donor identity. We use SNPRelate to infer the closest identity (IBS) of the patient's genotype status (IBS), seelii hin ramadamnee fi seelii akka duplexes adda baafamee fi arjoomtoota walsimsiisu saamuda ascites fi tumoor (54) gidduutti osoo hin dabalatin, nuyi haalawwan sadii bakka bu'iinsa seelii baay'ee tumor fi ascites keessatti xiinxala gara gadiitti qabannee erga tarkaanfii mass filtration scater (55) fi scran (56) BioConductor packaging keessatti raawwannee booda, kun seelii 697 argamsiise (2792 and 4183 cells from tumor and ascites, respectively) for analysis. We use igraph's (57) Louvain clustering of shared nearest neighbor network (SNN) based on Jaccard distance to cluster cells by expression. The clusters were manually annotated to putative cell types based on marker gene expression and visualized with t-SNE. Cytotoxic T cells are ibsa CD8A fi GZMA tiin ibsame, subclusters ibsa pirootiinii ribosomal gadi aanaa qaban osoo hin dabalatin, nuyi daataa maxxanfame Izar et al (16) arganne, t-SNE embedding isaanii dabalatee, ibsa wal-irra bu'uu mallattoolee seelii ittisa qaamaa fi ibsa NNMT gidduutti to'achuu danda'a.
PBMC oomishaalee adda baasuu liyuukoosaayitii (STEMCELL Technologies) irraa Ficoll gradient density centrifugation tiin adda baafamaniiru. Seelonni CD3 + PBMC irraa CD3 beads (Miltenyi) fayyadamuun adda baafamaniiru. MNA jiraachuu fi dhabamuu isaatiin seelonni CD3+ CD3 gabatee irratti hidhamee (5μg/ml), CD28 bulbulamaa (3μg/ml) fi IL-2 (300 U/ml; Proleukin) waliin hojiitti hiikamaniiru. Guyyaa dhumaa babal’inaatti, jiraachuu danda’uun (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) fi baay’inni (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) dhangala’aa saayitoomeetiriin madaalameera. Seelii PMA (20 ng/ml) fi ionomycin (1μg/ml) GolgiStop waliin sa'aatii 4f kakaasuun dalagaa effector madaaluu, fi CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) fi TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) hordofuu. Seelii qPCR fi ChIP PMA (20 ng/ml) fi ionomycin (1μg/ml) waliin sa’aatii 4f kakaasuu. ELISA supernatant PMA (20 ng / ml) fi ionomycin (1 μg / ml) sa'aatii 4f kaka'umsa duraa fi booda walitti qabame.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) fayyadamuun RNA adda baasuuf pirootokoolii oomishtootaa hordofaa. Saamuda homogenize gochuuf QIAshredder (QIAGEN) fayyadami. DNA dabalataa (cDNA) walnyaachisuuf kiitii RNA to cDNA dandeettii olaanaa qabu (Thermo Fisher Scientific) fayyadamuu. TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) fayyadamuun ibsa jiinii (akka pirootokoolii oomishtootaatti) qorannoowwan armaan gadiitiin safaruuf: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [giliraaldehaydii-3-fosfeetii haayidiroojiinii irraa (GAPDH)] fi Hs01010726_m1 (SLC22A2) dha. Saamudaaleen kun sirna PCR yeroo dhugaa StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) irratti MicroAmp fast optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems) keessatti fiilmii optikaalaa MicroAmp waliin hojjetameera. Gatiin Ct kamiyyuu 35 ol ta'e akka ulaagaa adda baasuu ol ta'ee fudhatama akkasumas akka hin adda baafamnetti mallatteeffameera.
Akkuma kanaan dura ibsametti ChIP raawwachuu (58). Gabaabumatti, seelonni foormaaldehaydiin (xiyyeeffannaan dhumaa 1.42%) wal’aanamanii daqiiqaa 10f ho’a kutaa keessatti inkuubeer ta’aniiru. Dabalataan dhiita'uu baafaara (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl fi 0.1% NP-40) daqiiqaa 10f ice irratti fayyadamuu, sana booda akka ibsametti immunoprecipitation buffer keessatti deebi'ee dhaabuu ( 58 ). Saamuda sana booda marsaa armaan gadiitiin sonicated ture: marsaa 10 (20 1-second pulses) fi yeroo static sekondii 40. Farra qaamaa sadarkaa ChIP immunoglobulin G (Teeknooloojii Mallattoo Seelii; 1μl), histone H3 (Teeknooloojii Mallattoo Seelii; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) fi SP1 (Teeknooloojii Mallattoo Seelii; 3μl) saamuda waliin halkan tokkoof raafama 4°CC irratti inkuubeer gochuu. Biqiloota pirootiinii A (Thermo Fisher Scientific) saamuda waliin 4°C irratti sa’aatii 1f suuta raasuun inkuubeer gochuu, sana booda biidiiwwan chelex (Bio-Rad) fayyadamuun DNA badhaadhina, fi pirootiinii K (Thermo Fisher) fayyadamuun bullaa’insa pirootiinii. Piroomootarri TNFα PCRn adda baafame: fuulduratti, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; faallaa kanaatiin, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (oomisha 207-bp). Suuraaleen kunniin Image Lab (Bio-Rad) tiin kan hojjetaman yoo ta’u, sooftiweeri ImageJ fayyadamuun lakkoofsaan kan murtaa’anidha.
Supernatant aadaa seelii akka armaan olitti ibsametti walitti qabame. Murteen kun akkaataa hojimaata oomishtootaa kiitii TNFα ELISA namaa (Invitrogen), kiitii IL-2 ELISA namaa (Invitrogen) fi kiitii IFN-γ ELISA namaa (Abcam) tiin raawwatameera. Akka pirootokoolii oomishtootaatti, supparnaataantiin TNFα fi IL-2 adda baasuuf 1:100, IFN-γ adda baasuuf ammoo 1:3n diilalla’eera. Xuuxuu 450 nm irratti safaruuf EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) fayyadamuu.
PBMC oomishaalee adda baasuu liyuukoosaayitii (STEMCELL Technologies) irraa Ficoll gradient density centrifugation tiin adda baafamaniiru. Seelonni CD3 + PBMC irraa CD3 beads (Miltenyi) fayyadamuun adda baafamaniiru. MNA jiraachuu fi dhabamuu isaatiin seelonni CD3+ CD3 gabatee irratti hidhamee (5μg/ml), CD28 bulbulamaa (3μg/ml) fi IL-2 (300 U/ml; Proleukin) waliin guyyoota 3f hojiirra oolan. Guyyaa 3 booda seelonni walitti qabamanii soogidda %0.9n dhiqaman, peeleetiinis snap frozen ta’e. Lakkoofsi seelii 123count eBeads fayyadamuun flow cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) tiin raawwatameera.
Meetaabolayitoota akka armaan olitti ibsametti baasuu. Bu’aan goggoge qindoomina seelii walqixa 4000/μl ta’een deebi’ee ijaarame. Saamuda kana kiroomaatoogiraafii marsaa duubatti deebi’ee (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) fi tarree CORTECS T3 (2.1×150 mm, guddina paartiikilii 1.6-μm, guddina qola 120-Å; #186008500, Waters) tiin xiinxaluu. Ispeektiroomeetira maas poolaarii (6470, Agilent), kan elektiroospray ayoonaayizeeshiniin haala pozaatiivii ta’een hojjetu. Marsaan socho’aa A %0.1 asiidii foormikii (H2O keessatti), marsaan socho’aa B %90 aseetoonitraayilii, %0.1 asiidii foormikii dha. LC gradient 100% A daqiiqaa 0 hanga 2, 99% B daqiiqaa 2 hanga 7.1, fi 99% B daqiiqaa 7.1 hanga 8. Sana booda tarree sana marsaa sochootuu A waliin saffisa yaa’aa 0.6 ml/min daqiiqaa 3f irra deebi’ii madaalchi. . Saffisni yaa’aa 0.4ml/min yoo ta’u, golli utubaa gara 50°Ctti ho’ifama. Yeroo qabachuu (RT) fi jijjiirama (RT = daqiiqaa 0.882, jijjiirama 1 = 137→94.1, jijjiirama 2 = 137→92 , Jijjiirraa 3 = 137→78) hundeessuuf istaandaardii keemikaalaa qulqulluu MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) fayyadamuu. Yeroo ce’umsi sadan isaanii yeroo qabachuu sirrii ta’etti yeroo uumaman, ce’umsi 1 adda ta’uu mirkaneessuuf baay’inaaf fayyadama. Istaandardii kaarviin MNA (Toronto Research Chemical Company) furmaata istookii (1 mg/ml) tartiiba ja’a diil’uushiniin uumamee istaandaardii 0.1, 1.0, 10 fi 100 ng/ml fi 1.0 fi 10μg/ml dhangala’aa argachuu danda’eera. Daangaan adda baasuu 1 ng/ml yoo ta’u, deebii sararaawaa 10 ng/ml fi 10μg/ml gidduutti argama. Tokkoon tokkoon lilmoo saamudaa fi istaandaardii maaykirooliitira lamaa xiinxala LC/MS tiif kan oolu yoo ta’u, tasgabbii waltajjii xiinxala mirkaneessuuf lilmoo saddeet hundatti saamuda to’annoo qulqullinaa walmakaa ni hojjetama. Deebiin MNA saamuda seelii MNAn wal’aanamanii hunda daangaa sarara qorannoo keessa ture. Xiinxalli odeeffannoo kan raawwatame sooftiweeri xiinxala baay’inaan MassHunter (v9.0, Agilent) fayyadamuun ture.
Ijaarsi αFR-CAR dhaloota lammaffaa Song et al. (59) jedhu. Gabaabumatti, ijaarsi kun qabiyyee armaan gadii of keessaa qaba: tartiiba hogganaa CD8a, ciccitaa jijjiiramaa sansalata tokkoo kan αFR adda ta’e namaa, naannoo hinjii fi meembraanii keessaa CD8a, domeenii seelii keessaa CD27 fi domeenii seelii keessaa CD3z. Tartiiba CAR guutuun GenScriptiin kan walnyaatame yoo ta’u, sana booda gara veektarii ibsa lentivaayirasii dhaloota lammaffaa olka’aa kaaseetii ibsa GFP gahumsa tiraanzisshinii madaaluuf fayyadamutti kloonii ta’e.
Lentiivaayirasiin kan uumamu seelii HEK293T tiraansifeekshiniin [American Type Culture Collection (ATCC); kan Dulbecco’s modified Eagle medium kan seerumi loonii daa’imaa %10 (FBS) fi %1 PenStrep of keessaa qabu keessatti guddate, fi veektarii CAR-GFP fi Pilaasmiidii paakeejii (psPAX2 fi pMD2.G, Addgene) lipofection amine (Sigma-Aldrich) fayyadamu. Suppernaataantiin vaayirasii of keessaa qabu erga tiraansifeekshinii booda sa’aatii 48 fi 72 booda walitti qabamee, calalamee, altiraasentiriifiigeeshiniin walitti qabame. Supernatant vaayirasii concentrated -80°C irratti hanga transduction tti kuusuu.
PBMCn oomishaalee adda baasuu liyuukoosaayitii arjooma fayyaa ta’an (STEMCELL Technologies) irraa Ficoll gradient density centrifugation tiin adda baafamu. Seelii CD8+ PBMC irraa adda baasuuf filannoo pozaatiivii CD8 microbeads (Miltenyi) fayyadamuu. Seelii T TransAct (Miltenyi) fi meediyaa TexMACS [Miltenyi; seerumi namaa %3 ho’aan hin sochoone, %1 PenStrep fi IL-2 (300 U/ml) tiin dabalameera]. Seelonni T kaka’umsa booda sa’aatii 24 booda lentivirus (10 μl concentrated virus supernatant per 106 cells) tiin jijjiiramaniiru. Guyyaa 1 hanga 3 booda Cytek Aurora irratti transduction (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ irratti), ibsa GFP seelii madaaluun gahumsa transduction yoo xiqqaate 30% agarsiisuu .
Seelonni CAR-T haala armaan gadiitiin Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep tiin dabalame) keessatti sa’aatii 24f aadaa godhaman: hin yaalamne, 250 μM adenosine ykn 10 mM MNAn wal’aanamaa turan. Erga dursanii wal’aanamanii booda, seelonni CAR-T PBSn dhiqamaniiru, seelonni SK-OV-3 20,000 waliin walitti makamaniiru [ATCC; meediyaa McCoy 5A (Sigma-Aldrich) keessatti FBS %10 fi PenStrep %1 10 irratti dabalame keessatti: Reeshiyoon effector fi target 1 meediyaa Immunocult dabalataa keessatti dachaa sadiin guddateera. Seelonni SK-OV-3 fi seelonni SK-OV-3 digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) waliin lysed akka to’annoo negaatiivii fi pozaatiiviitti fayyadamaniiru. Sa’aatii 24f waliin misoomsuun booda, supparnaataantiin walitti qabamee lakteetii dihaayidroojineesii (LDH) akkaataa qajeelfama oomishtootaatiin (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) safarameera. LDH supernatant LDH buffer keessatti 1:50 diluted ture. Dhibbeentaan ajjeechaa foormulaa armaan gadii fayyadamuun safarame: dhibbeentaa ajjeechaa = dhibbeentaa sirreeffama / saffisa ajjeechaa guddaa x 100%, bakka dhibbeentaan sirreeffama = seelii aadaa waliin-T qofa, fi saffisa ajjeechaa guddaa = to’annoo to’annoo-negaatiivii pozaatiivii.
Akkuma barruu ykn meeshaalee fi maloota keessatti ibsametti, xiinxala istaatiksiidhaaf GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ykn R v3.6.0 fayyadami. Yoo saamuda hedduun dhukkubsataa tokko irraa walitti qabame (kan akka ascites fi tumoor), qorannoo t lama lama fayyadamna ykn dhukkubsataa akka bu’aa tasaa moodeela sararaawaa ykn waliigalaa keessatti akka barbaachisummaa isaatti hammanna. Xiinxala meetaabooloomiksiif qormaanni barbaachisummaa dachaa sadii ta’ee raawwatama.
Barreeffama kanaaf meeshaalee dabalataa argachuuf, maaloo http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 ilaalaa
Kun barruu banaa ta’ee fi haala hayyama Creative Commons Attribution-Non-Commercial License jalatti raabsame yoo ta’u, kunis itti fayyadamni dhumaa bu’aa daldalaaf kan hin taanee fi yaadni isaa hojiin jalqabaa sirrii ta’uu isaa hanga ta’etti, meeshaa kamiinuu itti fayyadamuu, raabsuu fi baay’isuu kan hayyamu dha. Wabeeffannaa.
Hubachiisa: Namni ati fuula sanaaf gorsitu email sana akka argu akka barbaadduu fi spam akka hin taane akka beekuuf qofa teessoo email kee akka kennitu qofa si gaafanna. Teessoo email kamiyyuu hin qabannu.
Gaaffiin kun daawwataa ta'uu kee qorachuu fi ofumaan spam akka hin dhiyaanne ittisuuf kan gargaarudha.
Maarisaa K. Kilgour (Marisaa K. Kilgour), Saaraa Maakfarsan (Saaraa Maakfarsan), Looreen G. Zakaariyaas (Laawureen G. Zakaariyaas), Abiigaayil Elii Aris G. Waatsan (H. Waatsan), Joon Istaag (John Istaag), Biraadii H. Neelsan (Biraad H. Neelsan), Raalf J. De Beelaardiinii (Raalf J. Deeberardinis), Raasil G. Joons (Russell G. Joons), Fiinees T. Haamiiltan (Fiineas T.
MNAn ittisa seelii T ukkaamsuuf gumaacha kan godhu yoo ta'u, wal'aansa kaansarii namaatiif galma immunotherapy ta'uu danda'u bakka bu'a.
Maarisaa K. Kilgour (Marisaa K. Kilgour), Saaraa Maakfarsan (Saaraa Maakfarsan), Looreen G. Zakaariyaas (Laawureen G. Zakaariyaas), Abiigaayil Elii Aris G. Waatsan (H. Waatsan), Joon Istaag (John Istaag), Biraadii H. Neelsan (Biraad H. Neelsan), Raalf J. De Beelaardiinii (Raalf J. Deeberardinis), Raasil G. Joons (Russell G. Joons), Fiinees T. Haamiiltan (Fiineas T.
MNAn ittisa seelii T ukkaamsuuf gumaacha kan godhu yoo ta'u, wal'aansa kaansarii namaatiif galma immunotherapy ta'uu danda'u bakka bu'a.
©2021 Waldaa Guddina Saayinsii Ameerikaa. mirgi hunduu kan eegamedha. AAAS michuu HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef fi COUNTER ti. Guddina Saayinsii ISSN 2375-2548.