Karaa dhoksaa keessatti pirootiinii addaan baasuun kutaa seelii fi homeostasis eeguuf barbaachisaa dha. Adeemsa geejjibaa dhoksaa keessatti qoodinsa qola gidduu galeessa ta’een alatti, gaheen lipiidonni sassaabuu kinesin keessatti qaban gaaffii bu’uuraa yeroo dheeraaf turee fi ammallee deebii hin argannedha. Asitti, nuti 3D yeroo tokkotti multicolor ol'aanaa murtoo yeroo dhugaa suuraa in vivo mirkaneessuuf in vivo mirkaneessuuf pirootiinonni haaraa walnyaatame glycosylphosphatidylinositol-immobilized baay'ee dheeraa ceramide lipid moieties wajjin clustered fi ramadame endoplasms addaa Net exit site, kan pirootiinota transmembrane fayyadaman irraa adda. Dabalataanis, dheerinni sansalataa seraamaayidii meembraanii reetikulamii endoplaasmii keessatti filannoo saaguu kanaaf murteessaa ta'uu agarsiifna. Qorannoon keenya ragaa kallatti in vivo isa jalqabaa fe'umsa pirootiinii dheerina sansalata lipidii irratti hundaa'uun gara iddoowwan al-ergii filannoo karaa dhoksaa keessatti ramaduuf kenna.
Seelota yuukaariyootii keessatti pirootinoonni reetikulamii endoopilaasmii (ER) keessatti walnyaataman sana booda yeroo geejjibaa karaa dhoksaatiin gara bakka seelii isaanii isa sirrii ta’etti geessuuf adda baafamu (1). Kootiin-jiddugaleessa ta'een sassaabuu malees, yeroo dheeraaf lipiidonni murtaa'an akkasumas pirootiinota addaa (2-5) ta'an domeenii meembraanii addaa keessatti walitti qabuun akka qabxii ba'uu filannootti tajaajiluu akka danda'an tilmaamameera. Haa ta'u malee, ammallee ragaan kallattiin in vivo mala lipidii irratti hundaa'e kana mirkaneessuuf hin jiru. Rakkoo bu'uuraa kana furuuf, akkamitti pirootinoonni glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored (GPI-APs) ER irraa garaagarummaadhaan akka ergaman damma keessatti qoranne. GPI-APs pirootiinota fuula seelii adda addaa lipid-walqabateedha ( 6, 7). GPI-AP pirootiinii dhokataa ta’ee fi baala alaa meembraanii pilaasmaa irratti karaa kutaa gilgaalaayidii (GPI anchor) maxxanuudha. Isaan GPI anchors akka fooyya'iinsa hiikkaa boodaa konsarvaatiivii ER lumen keessatti fudhatu (8). Erga maxxanee booda, GPI-AP karaa meeshaa Golgi (5, 9) ER irraa gara pilaasmaa meembraaniitti darba. Argamuun GPI anchors GPI-AP pirootiinota transmembrane secreted (pirootinoota pilaasmaa membrane biroo dabalatee) irraa addatti karaa secretory (5, 9, 10) akka geejjibsiisu taasisa. Seelii damma keessatti, GPI-APs pirootiinota biroo endoplasmic reticulum keessatti dhokfaman irraa adda baafamu, achiis gara vesicles addaa kootii pirootiinii kompileeksii II (COPII) marfame (6, 7) keessatti paakeejii ta'u. Murteessitoonni adeemsa ramaddii kanaa adeemsa al-ergii ER keessatti ifa miti, garuu malan kun lipiidota barbaadu akka danda’u tilmaamameera, keessumaa caasaa haaromsa kutaa lipidii GPI anchor (5, 8). Damma keessatti, GPI lipid remodeling battaluma GPIn erga maxxanee booda kan jalqabu yoo ta’u, yeroo baay’ee, seraamiidiin asiidii coomaa guutuu sansalata dheeraa kaarboonii 26 qabu (C26:0) waliin akka walqabatu taasisa (11, 12). C26 ceramide seraamidii ijoo hanga ammaatti seelii dammatiin oomishamuudha. ER keessatti kan walnyaatamu yoo ta’u, irra caalaan isaa karaa veesikilii COPII gara meeshaa Golgiitti ergama (13). ER al-ergiin GPI-AP addatti walnyaatinsa seraamidii itti fufiinsa qabu barbaada ( 14 , 15 ), dabaree isaatiinis, jijjiiramni seraamaayidii gara inositol fosfeetii seraamaayidii (IPC) meeshaa Golgi keessatti walnyaatinsa anchor GPI irratti hundaa'a ( 16 ). Qorannoon baayoofiiziksii meembraanota namtolchee waliin taasifame akka agarsiisutti, seraamiidonni sansalata asiilii baayyee dheeraa ta’an walitti makamanii domeenii tartiiba qaban kanneen amaloota fiizikaalaa adda ta’an uumuu danda’u (17, 18). Daataan kunniin yaada C26 seraamaayidii fi GPI-AP C26 seraamaayidii waliin amaloota fiizikaalaa isaanii fayyadamuun naannoo tartiiba qabu ykn naannoo naannoo lipidii meembraanii ER baay’ee jeequmsa qabu keessatti walitti makamuu jedhutti geessu. Irra caalaa gilsaarooliipiidota gabaabaa fi hin guutamne (C16:1 fi C18:1) irraa kan ijaarame dha (19, 20). Naannoleen kun filannoodhaan iddoowwan ER ba’uu addaa (ERES) irratti kan xiyyeeffatan yoo ta’u, bakka seraamaayidii fi seraamaayidii irratti hundaa’e GPI-AP veesikilii COPII of kenne tokko keessatti gara Golgiitti waliin geejjibsiifamuu danda’u (5).
Qorannoon kun, nuti kallattiin mala lipidii irratti hundaa'e kana super-resolution confocal real-time imaging microscopy (SCLIM) fayyadamuun qoranneerra, kunis tooftaa maaykirooskoopii ammayyaa yeroo tokkotti pirootiinota fluorescently labeled ilaaluu danda'u Fakkiiwwan halluu sadii fi sadii-dimensional (3D) seelii lubbuu qaban keessatti resolution fi saffisa garmalee ol'aanaa qabu (21, 22).
Jalqaba teeknooloojii SCLIM hojiirra oolchine akkamitti GPI-AP idilee garee C26 ceramide waliin pirootiinota transmembrane secreted irraa erga ER S. cerevisiae keessaa bahee booda screened ta'e caalaatti ibsuuf. Ramaddii ER sakatta'uuf jecha, sirna jeneetikii kallattiin fe'umsa haaraa walnyaatame ERES seenu in vivo (7, 23) mul'isuu danda'u fayyadamne. Akka fe'umsaatti, nuyi C26 ceramide irratti hundaa'e GPI-AP Gas1 pirootiinii magariisa fluorescent (GFP) fi transmembrane secreted pirootiinii Mid2 dhiyoo-infrared fluorescent pirootiinii (iRFP) mallatteeffame filanne, isaan lamaan pilaasmaa membrane irratti xiyyeeffatan (24-26). Mutant sec31-1 temperature-sensitive keessatti, fe’umsi kun lamaan piroomootara galactose-inducible fi mallattoo ERES constitutive jalatti ibsamu. Teempireechara garmalee (37°C) irratti, sababiin isaas jijjiiramni sec31-1 dalagaa qaama kootii COPII Sec31 irratti dhiibbaa waan qabuuf biqiluu COPII fi al-ergii ER dhorkuuf, fe’umsi haaraa walnyaatame ER irratti kuufama (23). Erga gara ho'a gadi aanaa (24°C) qabbanaa'anii booda, seelonni sec31-1 mutant naannoo dhoksaa irraa deebi'anii, fe'umsi sinteetikii haaraan kuufame ER irraa ergamuu jalqabe. CLIM visualization agarsiise irra caalaan Gas1-GFP fi Mid2-iRFP haaraa walnyaatame ammallee ER seelii sec31-1 mutant keessatti kuufamee erga 37°C irratti inkuubeer ta'ee booda 24°C irratti daqiiqaa 5f gadhiifame (Fakkii 1). Mid2-iRFP guutummaa meembraanii ER irratti waan raabsameef, fi Gas1-GFP naannoo meembraanii ER walitti fufiinsa hin qabne keessatti walitti qabamee waan walitti qabameef, raabsiin isaanii guutummaatti adda (Fakkii 1, A hanga C fi Fiilmii S1). Kana malees, akkuma fakkii 1D irratti mul’atutti, kilaastarri Gas1-GFP Mid2-iRFP hin qabu. Bu’aan kunniin pirootinoonni GPI-AP fi transmembrane jalqaba naannoo ER membrane adda addaatti adda baafamuu isaanii agarsiisu. Tuutni Gas1-GFP ERES addaa pirootiinii kootii COPII mCherry Sec13 (Fakkii 1, E fi F, fi fiilmii S1) (23) tiin mallatteeffameetti dhihoo dha.
sec31-1 seelonni galaaktoosii-induced secretions ibsu, sansalata acyl dheeraa (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, magariisa) fi pirootiinii transmembrane Mid2-iRFP (TMP, blue) fi kun Constructive ERES labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37°C irratti daqiiqaa 30f incubated ture, gara 24°C, fi daqiiqaa 5 booda SCLIM tiin fakkii kaafame. (A hanga C) fakkii bakka bu’aa walitti makame ykn tokkicha 2D kan xiyyaara (A), fakkii pirojekshinii 2D kan kutaa z 10 (B) ykn fakkii 3D seelii hemisfeera mallattoolee fe’umsaa fi ERES (C) agarsiisa. Barri iskeelii 1μm (A fi B). Yuunitiin iskeelii 0.551μm (C) dha. Gas1-GFP naannoo ER addaan baafame ykn kilaastara keessatti kan argame yoo ta'u, Mid2-iRFP ammoo adda baafamee guutummaa meembraanii ER (C) keessatti raabsameera. (D) Giraafichi cimina fluorescence firaakshinii Gas1-GFP fi Mid2-iRFP kilaastara Gas1-GFP keessatti sarara xiyya adii (bitaa) irratti agarsiisa. AU, yuunitii fedhii ofiitiin. (E fi F) fakkii 3D kan meeshaalee fi mallattoo ERES walitti fidu bakka bu’u. Kilaastaroonni Gas1-GFP naannoo ERES addaatti argameera. Yuunitiin iskeelii 0.551μm dha. (F) Xiyyaan jabaan adiin tuuta Gas1-GFP ERES waliin walqabatee jiru mallatteessu. Paanaalii gidduu fi mirgaa fakkii 3D guddate walitti makamee fi ilaalcha naanneffame kilaastara Gas1-GFP filatame agarsiisu.
Hariiroon iddoo dhiyoo kilaastara Gas1-GFP fi ERES addaa gidduu jiru Gas1-GFP ERES filannoo keessa seenuu akka danda’u agarsiisa, kunis filannoo Mid2-iRFP ER keessaa ba’uuf fayyadamu irraa adda. Carraa kana furuuf meeshaa tokko ykn lama qofaaf reeshiyoo ERES safarfne (Fakkii 2, A hanga C). ERES irra caalaan (%70) gosa fe’umsaa tokko qofa akka qaban arganne. Fakkiin jalaa fakkii 2C fakkeenyota addaa lama kan ERES Gas1-GFP qofa qabu (Fakkii 1) ykn Mid2-iRFP qofa (fakkii 2) agarsiisa. Faallaa kanaatiin, tilmaamaan %20 ERES fe’umsa lama kan naannoo tokkotti wal-irra bu’an of keessaa qaba. ERES tokko tokko (%10) fe’umsa gosa lama kan of keessaa qaban ta’uun isaanii kan argame yoo ta’u, garuu naannoo ifatti adda ta’etti adda baafamaniiru. Kanaafuu, xiinxalli istaatiksii kun akka agarsiisutti ER erga ergamee booda GPI-AP Gas1-GFP fi fe’umsi transmembrane Mid2-iRFP ERES adda addaatti qoodamu (Fakkii 2D). Gahumsi sassaabuu kun xiinxala baayookeemikaalaa kanaan duraa (6) fi murtii morfoloojii (7) wajjin baay’ee walsima. Akkasumas amala fe’umsa adda baafamee ERES seenu ilaaluu dandeenya (Fakkii 2E fi Fiilmii S2). Fakkiin 2E kan agarsiisu Gas1-GFP (panel 3) ykn Mid2-iRFP (panel 4) keessaa kutaan xiqqaan qofti gama tokkoon ERES seenee naannoo addaan baafame keessatti kan daangeffame ta’uu isaati. Paaneliin 5 fakkii 2E akka agarsiisutti Gas1-GFP fi Mid2-iRFP yeroo tokko tokko ERES tokko keessatti kan argaman yoo ta’u, garuu gama adda addaa irraa kan seenanii fi naannoo adda addaa keessatti kan walitti qabaman yoo ta’u isaanis veesikilii COPII adda addaa bakka bu’uu danda’u. Akkasumas addaan baafamuu fi ramaddiin C26 ceramide-bu'uura GPI-AP Gas1 akka filannoo EREStti ilaalame adda ta'uu isaa mirkaneessine sababiin isaas fe'umsa dhangalaa'uu transmembrane kan biraa, pirootiinii meembraanii pilaasmaa GFP-tagged Axl2 (27 ), Mid2-iRFP amala walfakkaatu agarsiisu. (Fakkii S1 fi Fiilmii S3). Axl2-GFP haaraa walnyaatame karaa ER membrane akka Mid2-iRFP (Fakkii S1, A fi B) raabsama, fi Mid2-iRFP waliin ERES irra caalaan keessatti co-localized (Fakkii S1, B hanga D). Paanaalii 1 fi 2 fakkii 1. S1C fakkeenyota addaa lama ERES bakka fe’umsi transmembrane lama wal-irra bu’an agarsiisa. Haalota kanneen keessatti meeshaaleen lamaan ERES waliin seenu (Fakkii S1E, Paanaalii 3 fi Fiilmii S3).
Seelonni sec31-1 galaaktoosii inducible secretions ibsan, Gas1-GFP (GPI-AP, magariisa) fi Mid2-iRFP (TMP, blue) fi constitutive ERES labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37 irratti kaa'aman Erga daqiiqaa 30f °C irratti inkuubeer ta'anii booda, gara 24 °C socho'uun secretion block gadhiisuuf, fi suuraa SCLIM booda Daqiiqaa 20. (A hanga C) Fakkiiwwan pirojekshinii 2D bakka bu’oota (A; barruu iskeelii, 1μm) ykn fakkiiwwan hemisfeera seelii 3D (B fi C; yuunitii iskeelii, 0.456μm) fe’umsaa fi kutaalee z 10 ERESn mallatteeffaman. Paaneliin gadii (B) keessatti fi paanaalii (C) keessatti fakkiiwwan adeemsifame agarsiisa meeshaalee ERES (magenta) keessatti argaman qofa agarsiisuuf [Gas1-GFP (halluu diimaa) fi Mid2-iRFP (buluu ifaa)]. (C) Xiyya banaa: ERES fe’umsa tokko qofa (1 hanga 4) baata. Xiyya halluu diimaa qabu: ERES fe’umsa adda baafame of keessaa qaba (5). Xiyya jabaa adii: ERES fe’umsa bakka tokkotti argamu of keessaa qabu. Armaan gaditti: ERES tokkichi filatame Gas1-GFP (1) ykn Mid2-iRFP (2) qofa of keessaa qaba. Barruu iskeelii, 100 nm. (D) Kuuntifikeeshinii footomaayikiroogiraafii (C) keessatti ibsame. Giddugaleessa dhibbeentaa ERES kan fe’umsa tokko qofa of keessaa qabu (Gas1-GFP ykn Mid2-iRFP), fe’umsa adda baafamee fi fe’umsa wal-irratti wal-caalu. Yaalii of danda’e sadii keessatti, n=432 seelii 54 keessatti. Barruu dogongoraa = SD. Qormaata t kan hin lamaa kan funyaan lamaa. *** P = 0.0002 ta’a. (E) Fakkii 3D ERES filatamaa fe’umsa adda baafamee (C) mallatteeffame. Gas1-GFP (magariisa) (3) ykn Mid2-iRFP (buluu) (4) gama tokkoon ERES (magenta) kan seenu yoo ta’u, ERES keessaa naannoo xiqqaa tokkotti daangeffama. Yeroo tokko tokko, gosti fe’umsaa lamaan gama tokkoon ERES tokko (5) tokkotti seenuudhaan ERES keessaa bakka adda baafame tokkotti daangeffama. Barruu iskeelii, 100 nm.
Itti aansuudhaan, nuyi yaada dheeraan sansalata asiilii seraamiid (C26) ER meembraanii keessatti argamu adda ta'e clustering fi saaguu Gas1 gara filannoo ERES oofu jedhu qoranne. Kanaaf, nuyi gosa damma fooyya'e GhLag1 fayyadamne, kan lamaan endogenous ceramide synthases Lag1 fi Lac1 GhLag1 (the Lag1 homolog of cotton) bakka bu'an, bu'aan isaas gosa damma gosa seelota membraanii Ceramide gosa bosona caalaa gabaabaa ta'e (Fakkii 3A) (28). Xiinxalli ispeektiroomeetirii maas (MS) akka agarsiisutti, gosoota gosa bosona keessatti, seraamaayidii waliigalaa keessaa %95 seraamaayidii sansalata baay’ee dheeraa (C26) yoo ta’u, GhLag1 keessatti ammoo seraamaayidii %85 baay’ee dheeraa (C18 fi C16) dha. ), seraamaayidii %2 qofatu seraamaayidii sansalata baay’ee dheeraa (C26) dha. C18 fi C16 seraamaayidii hanga ammaatti meembraanii GhLag1 keessatti argaman keessaa seraamiidii ijoo ta’anis, xiinxalli MS akkasumas GPI anchor Gas1-GFP gosa GhLag1 keessatti ibsame C26 ceramide kan of keessaa qabu ta’uu isaa mirkaneessee jira, kunis lipiidota gosa bosona waliin wal madaala. Qulqullinni isaas kanuma (Fak. 3A) (26). Kanaafuu, kun jechuun inzaayimiin seraamaayidii haaromsuu Cwh43 C26 seraamidiidhaaf filannoo olaanaa qaba, akkuma fakkii 26 irratti mul’atutti, filannoodhaan GPI anchor hamma xiqqaa C26 seraamidii gosa GhLag1 keessatti hammata. S2 (29) jedhamuun beekama. Kanas ta'e sana, meembraaniin seelii GhLag1 bu'uuraan C18-C16 seraamidii qofa kan of keessaa qabu yoo ta'u, Gas1-GFP ammallee C26 seraamidii qaba. Dhugaan kun gosti kun rakkoo dheerina sansalata asiilii meembraanii seraamaayidii ER keessatti addatti furuuf meeshaa gaarii taasisa. Gahee yaadame gitaa fi sassaabuu. Sana booda, nu jalqaba dandeettii C26 Gas1-GFP GhLag1 keessatti tuuta keessatti kuufamuu qoranne ho'a-miira mutant allele sec31-1 karaa barame fluorescence microscopy, bakka qofa dheeraa (C18-C16) sansalata ER membrane Ceramide keessatti jira (Fak. 3). Nu sec31-1 keessatti, irra caalaan Gas1-GFP kilaastaroota keessatti kan walitti qabame yoo ta'u, Gas1-GFP sec31-1 GhLag1 dheeraa (C18-C16) dheeraa seraamiid ER meembraanii wajjin irra caalaa hin tuutamee fi raabsamee In guutummaa ER meembraanii keessatti akka hin taane ilaalle. Sirritti dubbachuuf, sababni isaas C26 ceramide-based clustering ERES addaa wajjin walitti dhiyeenyaan kan walqabatu waan ta'eef (Fakkii 1), nuti itti aansee adeemsi kun dalagaa mala pirootiinii ER al-ergiis hirmaachisuu danda'uu fi dhiisuu isaa qoranne. GPI-AP sirna addaa COPII ER al-ergii fayyadama, kunis Ted1′s caasaa remodeling kutaa glycan GPI anchor (30, 31) dammaqinaan to’atama. Sana booda recombinant GPI-glycan kan beekamu transmembrane cargo receptor p24 complex, kunis dabaree isaatiin filannoodhaan Lst1 bobbaasa, kunis isoform addaa COPII cargo hinding subunit guddaa Sec24, GPI-AP-badhaadhe COPII uumuu Vesicles barbaachisaa dha (31-33). Kanaaf, nuyi dachaa mutant kan haquu pirootiinota tokkicha kana (qaama walxaxaa p24 Emp24, GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 fi addaa COPII subunit Lst1) gosa mutant sec31-1 waliin walitti fide ijaarree, isaan qorannee Gas1-kilaastara GFP uumuun ni danda'ama (Fakkii 3). Nu sec31-1emp24Δ fi sec31-1ted1Δ keessatti, Gas1-GFP irra caalaa unclustered fi guutummaa ER membrane keessatti raabsame, akkuma kanaan dura sec31-1 GhLag1 keessatti mul'ate, sec31-1lst1Δ keessatti, Gas1-GFP Akkuma sec31-1 keessatti akka ta'e ilaalle. Bu'aawwan kunniin akka agarsiisanitti, argama C26 ceramide ER membrane keessatti dabalatee, clustering Gas1-GFP akkasumas p24 complex waliin hidhamuu qaba, fi Lst1 addaa recruitment hin barbaadu. Sana booda, dheerinni sansalataa seraamiid meembraanii ER keessatti hidhamuu Gas1-GFP gara p24 to'achuu akka danda'u qoranne. Haa ta'u malee, argamuun C18-C16 ceramide meembraanii keessatti GPI-glycans reconstructed by the p24 complex (Fakkii S3 fi S4, A fi B) ykn GPI-APtti hidhamuu fi GPI-AP erguu irratti dhiibbaa akka hin qabne arganne. dandeettii. Gosa xiqqaa COPII Lst1 qacarrii (Fakkii S4C). Kanaafuu, C26 ceramide-hirkataa kilaastariin mala pirootiinii al-ergii ER adda addaa wajjin wal-nyaatinsa pirootiinii hin barbaadu, garuu mala sassaabuu filannoo dheerina lipidiitiin oofu ni deeggara. Sana booda, dheerinni sansalata asiilii seraamiid meembraanii ER keessatti ramaddii bu'a qabeessa Gas1-GFP akka filannoo EREStti barbaachisaa ta'uu isaa xiinxalle. Gas1 gosa GhLag1 kan seraamaayidii sansalata gabaabaa qabu ER keessaa bahee meembraanii pilaasmaa keessa waan seenuuf (Fakkii S5), yoo sassaabni dheerina sansalata asiilii seraamaayidiitiin oofe, Gaas1 gosa GhLag1 keessa jiru gara biraatti qajeelfamuu fi qaxxaamuruu akka danda’u ni amanna. Meeshaalee ERES kanneen meembraanii walfakkaataa qaban.
(A) Meembraaniin seelii GhLag1 irra caalaa C18-C16 seraamiidota gabaabaa kan of keessaa qabu yoo ta’u, GPI anchor Gas1-GFP ammallee C26 IPC seelii gosa bosonaa wajjin walfakkaatu qaba. Gubbaa: xiinxala dheerina sansalata asiilii seraamaayidii meembraanii seelii gosoota gosa bosona (Wt) fi GhLag1p keessatti ispeektiroomeetirii baay’inaan (MS). Daataan kun dhibbeentaa waliigala seraamaayidii bakka bu’a. Giddugaleessaan yaalii of danda’e sadii. Barruu dogongoraa = SD. Qormaata t kan hin lamaa kan funyaan lamaa. **** P <0.0001. Paanaalii jalaa: Xiinxala MS dheerina sansalata asiilii IPC ankuraa GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) keessatti argamu gosoota gosa bosonaafi GhLag1p keessatti ibsame. Daataan dhibbeentaa mallattoo waliigalaa IPC bakka bu’a. Giddugaleessaan yaalii of danda’e shan. Barruu dogongoraa = SD. Qormaata t kan hin lamaa kan funyaan lamaa. ns, barbaachisaa miti. P = 0.9134 ta’a. (B) Maaykiroogiraafiin fluorescence sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ fi sec31-1lst1Δ seelii galactose-induced Gas1-GFP ibsan daqiiqaa 30f 37°C irratti inkuubeer ta'anii booda Perform routine fluorescence microscopy 24°C ta’a. Xiyya adii: Kilaastara ER Gas1-GFP. Xiyya banaa: Gaas1-GFP kan hin tuutamne guutummaa meembraanii ER irratti raabsama, kunis amala ER niwukilarii gilgaala faaluu agarsiisa. Barruu iskeelii, 5μm. (C) Kuuntifikeeshinii footomaayikiroogiraafii (B) keessatti ibsame. Giddugaleessa dhibbeentaa seelii caasaa Gas1-GFP punctate qaban. Yaalii of danda’e sadii keessatti, seelonni n≥300. Barruu dogongoraa = SD. Qormaata t kan hin lamaa kan funyaan lamaa. **** P <0.0001.
Kallattiin rakkoo kana furuuf, nu SCLIM mul'isuu Gas1-GFP fi Mid2-iRFP GhLag1 keessatti sec31-1 ho'a-miira mutant allele (Fakkii 4 fi Fiilmii S4) raawwanne. Erga ER 37°C irratti qabamee booda 24°C irratti gadhiifamee booda, irra caalaan Gas1-GFP haaraa walnyaatame akka maaykirooskooppii baratameen ilaalametti, tuutamee fi guutummaa meembraanii ER keessatti hin raabsamne (Fakkii 4, A fi B). Kana malees, dhibbeentaan guddaan ERES (%67) gosoota fe’umsaa lama kan waliin argamu of keessatti qabata (Fakkii 4D). Paaneliin 1 fi 2 fakkii 4C fakkeenyota addaa lama ERES kan Gas1-GFP fi Mid2-GFP wal-irra bu’an agarsiisu. Kana malees, meeshaaleen lamaan ERES tokko keessatti bobbaafamaniiru (Fakkii 4E, paanaalii 3 fi fiilmii S4). Kanaafuu, bu’aan keenya dheerinni sansalata asiilii seraamaayidii meembraanii ER keessatti argamu walitti qabamuu fi ramaddii pirootiinii ER murteessaa barbaachisaa ta’uu agarsiisa.
Sec31-1 GhLag1 seelonni galaaktoosii-induced secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, magariisa) fi Mid2-iRFP (TMP, halluu diimaa) fi constitutive ERES-labeled Sec13-mCherry (ERES, magenta) ibsan 37°C irratti inkuubeer. Daqiiqaa 30f itti fufi, gara 24°C gadi bu’uun dhangala’aa gadhiisi, daqiiqaa 20 booda SCLIMn fakkii kaa’i. (A hanga C) Fakkiiwwan pirojekshinii 2D bakka bu’oota (A; barruu iskeelii, 1μm) ykn fakkiiwwan hemisfeera seelii 3D (B fi C; yuunitii iskeelii, 0.45μm) kutaalee z 10 fe’umsaa fi ERESn mallatteeffaman. Paaneliin gadii (B) keessatti fi paanaalii (C) keessatti fakkiiwwan adeemsifame agarsiisa meeshaalee ERES (magenta) keessatti argaman qofa agarsiisuuf [Gas1-GFP (halluu diimaa) fi Mid2-iRFP (buluu ifaa)]. (C) Xiyya adiin guutame: ERES, meeshaaleen wal-irra bu’uu. Xiyya banaa: ERES wanta tokko qofa of keessaa qaba. Paanaalii gadii: ERES filatame meeshaalee wal-irra bu’an (1 fi 2) kan (C) keessatti mallatteeffaman qaba. Barruu iskeelii, 100 nm. (D) Kuuntifikeeshinii footomaayikiroogiraafii (C) keessatti ibsame. Yuunitii sec31-1 fi sec31-1 GhLag1 keessatti fe’umsi tokko qofti (Gas1-GFP ykn Mid2-iRFP) kan hammatame yoo ta’u, fe’umsa adda baafamee fi fe’umsa wal-irratti wal-caaluuf giddugaleessa dhibbeentaa ERES. Yaalii of danda’e sadii keessatti, n = 432 seelii 54 keessatti (sec31-1) fi n = 430 seelii 47 keessatti (sec31-1 GhLag1). Barruu dogongoraa = SD. Qormaata t kan hin lamaa kan funyaan lamaa. *** P = 0.0002 (sec31-1) fi ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1) ta’a. (E) Fakkii 3D ERES filatamaa fe’umsa wal-irratti (3) (C) keessatti mallatteeffamee wajjin. Gas1-GFP (magariisa) fi Mid2-iRFP (buluu) gama tokkoon ERES (magenta)tti dhiyaatanii naannoo ERES daangeffame tokko keessa turu. Barruu iskeelii, 100 nm.
Qorannoon kun fe’umsi pirootiinii lipidii irratti hundaa’e karaa dhoksaa keessatti iddoowwan al-ergii filannootti akka ramadaman ragaa kallattiin in vivo keessatti kenna, akkasumas barbaachisummaa dheerina sansalata asiilii filannoo ramaddiitiif mul’isa. Tooftaa maaykirooskoopii humna guddaa qabuu fi sadarkaa olaanaa qabu SCLIM jedhamu fayyadamuun, nuyi haaraa walnyaatame Gas1-GFP (a guddaa pilaasmaa meembraanii GPI-AP baay'ee dheeraa acyl chain (C26) ceramide lipid portion) damma keessatti agarsiifne ) The regions clustered in discrete ERs are associated with specific ERES, while transmembrane secreted proteins are distributed throughout the ER membrane (Fakkii 1). Kana malees, meeshaaleen gosa lamaan kun ERES adda addaa filannoodhaan seenu (Fakkii 2). Dheerinni sansalata asiilii seraamaayidii seelii meembraanii keessa jiru C26 irraa gara C18-C16tti hir’ata, kilaastarri Gas1-GFP gara naannoo ER addaan baafametti jeeqama, akkasumas Gas1-GFP pirootiinii meembraanii qaxxaamuraa waliin ER keessaa ba’uuf karaa ERES walfakkaatuun karaa irra deebi’amee jira (Fakkii 3 fi Fakkii 3). 4).
GPI-AP ER keessaa ba'uuf mala pirootiinii addaa fayyadamus, addaan bahuun C26 seraamiid irratti hirkate wal-nyaatinsa pirootiinii adda addaa kan ERES adda ta'uu danda'u irratti akka hin hirkanne arganne (Fakkii S4 fi S5). Inumaayyuu, argannoon keenya mala ramaddii filannoo kan pirootiinii lipidii irratti hundaa’e walitti qabuu fi booda fe’umsa biroo hambisuun oofu ni deeggara. Tajaajilli keenya naannoon Gas1-GFP ykn kilaastarri ERES addaa wajjin walqabatu pirootiinii transmembrane secreted Mid2-iRFP akka hin qabne agarsiisa, kunis C26 ceramide-hirkataa GPI-AP cluster akka isaan ERES barbaachisaa ta'etti akka seenan haala mijeessa, fi yeroo wal fakkaatutti, transmembrane hambisu The secretions enter this particular ERES (Fakkii 1 fi 2). Faallaa kanaatiin, seraamiidonni C18-C16 meembraanii ER keessatti argamuun GPI-AP naannoo ykn tuutaa akka uumu hin godhu, kanaaf pirootiinota meembraanii keessaa dhokfaman gara ERES walfakkaataatti hin hambisan ykn hin bakka buusan (Fakkii 3 fi 4). . Kanaafuu, C26 seraamiid pirootiinota ERES addaa wajjin walqabatan walitti qabuuf haala mijeessuudhaan addaan baafamuu fi ramaddii akka oofu yaada dhiheessina.
Akkamitti C26 seraamidii irratti hirkate kana gara naannoo ER murtaa’etti galmaan ga’uu dandeenya? Amalli seraamaayidii meembraanii gara cinaatti adda ba’uu naannoo lipidii sirrii hin taane meembraanii ER kan gilsaarooliipiidota gabaabaa fi hin guutamne of keessaa qabu keessatti GPI-AP fi C26 seraamaayidii lipiidota xixiqqoo fi battalumatti tartiiba qaban akka uumuu danda’u gochuu danda’a. Kilaastaroota qulqullinaa (17, 18). Tuutni yeroo xixiqqoo kunniin erga kompileeksii p24tti hidhamanii booda daran gara tuutaa gurguddoo, tasgabbaa’oo ta’anitti walitti makamuu danda’u ( 34 ). Kana waliin kan walsimu, C26 Gas1-GFP tuutawwan mul'atan gurguddoo uumuuf kompileeksii p24 waliin wal-nyaachuu akka qabu agarsiifne (Fakkii 3). Kompileeksii p24 oligoomeerii heterozaayigoosii pirootiinota p24 transmembrane adda addaa afur damma keessatti ( 35 ) keessatti ijaarame yoo ta'u, kunis hidhata maltiivaaleentii kenna, kunis qaxxaamuraa-walqabsiisuu tuutaawwan GPI-AP xixiqqoo, kanaanis kilaastara Tasgabbaa'aa guddaa maddisiisuu danda'a ( 34 ). Wal-nyaatinsi pirootiinii ectodomains GPI-APs gidduu jirus walitti qabama isaaniif gumaachuu danda'a, akkuma yeroo geejjibaa Golgi isaanii seelii epithelial hoosistoota polarized keessatti agarsiifame ( 36 ). Haa ta’u malee, yeroo C18-C16 ceramide ER membrane keessatti argamu, yeroo p24 complex Gas1-GFP waliin walqabatu, tuutaaleen adda ta’an gurguddoon hin uumaman. Malli bu’uuraa amaloota fiizikaalaa fi keemikaalaa addaa seraamaayidii sansalata asiilii dheeraa irratti hundaa’uu danda’a. Qorannoon baayoofiiziksii meembraanota namtolchee akka agarsiisutti, seraamiidoonni sansalata asiilii dheeraa (C24) fi gabaabaa (C18-C16) lamaan isaanii addaan bahuu marsaa fiduu kan danda’an ta’us, seraamaayidii sansalata asiilii dheeraa (C24) qofatu fiilmii sana irra deebi’ee bocuuf Curvature ol’aanaa fi filmii qaxxaamuruu guddisuu danda’a. Karaa wal wabii (17, 37, 38). Heeliiksiin transmembrane TMED2, homologue namaa Emp24, filannoodhaan C18 ceramide-based sphingomyelin waliin cytoplasmic lobules keessatti akka wal-nyaatu agarsiifameera ( 39 ). Fakkeenya molakiyuulaa daayinamiksii (MD) fayyadamuun, C18 fi C26 ceramides lamaan naannoo cytoplasmic lobules Emp24 transmembrane helix kuufamuu, fi isaan filannoo walfakkaataa akka qaban arganne (Fakkii S6). Kun kan agarsiisu transmembrane helix Emp24 raabsa asymmetric lipids membrane keessatti fiduu akka danda'u hubachuun barbaachisaadha. Kun bu’aa dhiheenya kana seelii hoosistootaa irratti hundaa’eedha. Fakkeenyonni MD walfakkaatan akkasumas argama lipiidota eeterii agarsiisu (40) . Kanaafuu, C26 ceramide lobules lamaan ER26 keessatti naannootti badhaadhina akka qabu tilmaamna. GPI-AP luminal lobules keessatti kallattiin multivalent p24 fi kuufamni C26 ceramide naannoo p24 cytoplasmic lobules keessatti yeroo walqabatu, walitti qabama Pirootiinii fi membrane curvature waliin dhufu karaa qubaa (41) uumamu guddisuu danda'a, GPI-AP gara naannoo addaan ba'ee ERES cinaatti akka adda ba'u taasisa, kunis baay'ee curved ta'e ni fayyada naannoolee meembraanii ER ( 42 ). Gabaasaaleen kanaan duraa mala yaadame kana deeggaran (43, 44). Hidhamni maltivaaleentii oligolectins, pathogens ykn antibodies ceramide-based glycosphingolipids (GSL) pilaasmaa meembraanii irratti walitti qabama GSL guddaa kakaasa, addaan bahuu marsaa guddisuu fi meembraanii difoormeeshinii fi keessa galchuu fida ( 44 ). Iwabuchi fi kkf (43) Sansalatni asiilii dheeraan (C24) garuu gabaabaa hin taane (C16) yoo jiraate, ligaandiin maltiivaaleentii GSL laktoosiilseeraamaayidiitti hidhamee tuuta gurguddaa fi weerara meembraanii akka uumamu kan kakaase yoo ta’u, saayitoopilaasmii Lyn-jiddugaleessa ta’e dabarsuu mallattoo baala irratti sansalata asiilii wal-qabsiifameen akka wal-qoodamu ta’uun isaa argameera niwutiroofiilota.
Seelii epithelial polarized hoosistootaa keessatti, qindoominni networkii farra Golgi (TGN) hanga sadarkaa meembraanii pilaasmaa apical addaan baafamuu fi sassaabuu GPI-AP to'ata ( 10 , 45 ). Walitti qabamuun kun GPI-AP oligomerization ( 36 ) tiin kan oofu yoo ta'u, garuu dheerina sansalata seraamidii damma keessatti argannu irrattis hundaa'uu danda'a. GPI-AP hoosistootaa ether lipid-based anchor qabaatus, fi caasaan keemikaalaa isaa baayyee dheeraa acyl chain ceramide irraa baayyee adda ta'us, qorannoon dhiheenya kana gaggeeffame akka agarsiisutti lipids lamaan jijjiirama fiizikaalaa fi keemikaalaa walfakkaataa fi dalagaa qaban (40). Kanaafuu, kutaan lipidii eeterii seelii hoosistootaa keessatti argamu damma keessatti seraamaayidii C26 wajjin wal fakkaachuu danda’a, gaheen isaas walitti qabamuu fi addaan baasuu GPI-AP guddisuuf seraamaayidii sansalata dheeraa meembraanii keessatti argamu waliin walqabsiisuudha. Carraan kun ammallee kallattiin qoratamuu kan qabu ta’us, argannoowwan kanaan duraa geejjibni seraamaayidii sansalata asiilii dheeraa gara qaama Golgiitti pirootiinota dabarsoo saayitoopilaasmiitiin akka hin raawwatamne, garuu walnyaatinsa ankuraa GPI kan akka damma irratti akka hundaa’u deeggaru. Kanaafuu, mala konsarvaatiivii jijjiirama jireenyaa (evolutionary conservative mechanism) seraamidii sansalata asiilii baay’ee dheeraa fi GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) veesikilii geejjibaa walfakkaataa keessatti filannoodhaan waliin geejjibsiisuu waan danda’u fakkaata.
Sirna seelota epithelial damma fi hoosistootaa keessatti, walitti qabamuu fi pirootiinota meembraanii pilaasmaa biroo irraa adda bahuun GPI-AP hundi isaanii osoo fuula seelii hin ga’iin dura ni uuma. Paladino fi kkf. (48) TGN seelota epithelial polarized hoosistootaa irratti, GPI-AP clustering ramaddii filannoo GPI-APs gara apical pilaasmaa membrane qofaaf barbaachisaa ta'uu qofa osoo hin taane, gurmaa'ina clustering GPI-APs fi sochii baayoloojii Isaas ni to'ata jedhanii argan. Fuula seelii. Damma keessatti, qorannoon kun C26 ceramide-hirkataa GPI-AP kilaastara ER irratti gurmaa'ina kilaastara fi sochii dalagaa GPI-AP pilaasmaa meembraanii irratti to'achuu akka danda'u agarsiise ( 24 , 49 ). Moodeela kanaan walsimuun, seelonni GhLag1 inhibiitaroota GPI ykn qoricha qulqullina dallaa seelii irratti dhiibbaa geessisan alarjii qabu ( 28 ), fi barbaachisummaan kilaastaroota Gas1-GFP dalagaa ( 49 ) kan fiixee seraamiid walhormaata seelii damma keessatti pirojektii ta'e G Bu'aa fiiziyoloojii seelota hLag1 ta'uu danda'u agarsiisa. Dogoggora GPI-AP. Haa ta'u malee, gurmaa'insi dalagaa fuula seelii mala sassaabuu dheerina lipidii irratti hundaa'een ER irraa sagantaa qabaachuu isaa qorachuun dabalataa qorannoo keenya gara fuula duraa ta'a.
Gosoonni Saccharomyces cerevisiae hojii kana keessatti fayyadaman gabatee S1 irratti tarreeffamaniiru. Gosoonni SCLIM MMY1583 fi MMY1635 suuraa seelii lubbuu qabuuf duubbee W303 keessatti ijaaramaniiru. Gosoonni kunniin Sec13-mCherry kan pirootiinii fluorescent tag waliin ibsan mala polymerase chain reaction (PCR) irratti hundaa'e pilaasmiidii pFA6a akka unkaatti fayyadamuun ijaaramaniiru ( 23 ). Gosti Mid2-iRFP ibsu pirootiinii fluorescent tiin mallatteeffame to’annoo piroomootara GAL1 jalatti akka armaan gadiitti ijaarameera. PCR amplification tartiiba iRFP-KanMx veektarii pKTiRFP-KAN irraa (kennaa E. O'Shea, Addgene pilaasmiidii lakkoofsa 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; adda baastuu qabeenya qorannoo (RRID): Addgene_64687) Akkasumas C-terminus endogenous Mid2 keessa galfame. Tartiiba jiinoomii Mid2-iRFP erga guddifamee gara piroomootara GAL1tti kloonii ta’ee booda, bakka Not I-Sac I pilaasmiidii walitti makamuu pRS306tti walitti makame. Pilaasmiidii pRGS7 bu’aa argame Pst I waliin sararaan ta’ee bakka URA3 keessatti walitti makame.
Jiiniin fiyuushinii Gas1-GFP pilaasmiidii seentiroomeerii (CEN) keessatti to’annoo piroomootara GAL1 jalatti kan ibsamu yoo ta’u, kunis akka armaan gadiitti ijaarama. Tartiiba Gas1-GFP pilaasmiidii pRS416-GAS1-GFP (24) (kenna L. Popolo) irraa PCRn guddifamee gara iddoo Xma I–Xho I pilaasmiidii CEN pBEVY-GL LEU2 (kenna C) tti kloonii ta’e. Miller; Lakkoofsi pilaasmiidii jiinii 51225; http://n2t.net/addgene: 51225 irratti kan argamu; RRID: Dabalata_51225). Pilaasmiidiin argame pRGS6 jedhamee moggaafame. Jiiniin fiyuushinii Axl2-GFP akkasumas to’annoo piroomootara GAL1 veektarii pBEVY-GL LEU2 jalatti kan ibsamu yoo ta’u, ijaarsi isaas akka armaan gadiitti argama. Tartiiba Axl2-GFP pilaasmiidii pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) irraa PCRn guddate, fi bakka Bam HI-Pst I veektarii pBEVY-GL LEU2 keessatti kloonii ta'e. Pilaasmiidiin argame pRGS12 jedhamee moggaafame. Tartiiba oligoonukleeyootaayidoota qorannoo kana keessatti fayyadaman gabatee S2 irratti tarreeffameera.
Gosti kun %0.2 adenine fi %2 gilukoosii [YP-dextrose (YPD)], %2 raffinose [YP-raffinose] badhaadhina damma baafame pirootiinii p (YP) meediyaa (1 % Damma extract fi 2% pirootiinii ept) dabalameera. (YPR)] or 2% galactose [YP-galactose (YPG)] as a carbon source, or in a synthetic minimal medium (0.15% yeast nitrogen base and 0.5% ammonium sulfate) to supplement appropriate amino acids and bases required for nutrition , And containing 2% glucose (synthetic glucose minimal medium) or 2% galactose (sintetiksii galaaktoosii minimal medium) akka madda kaarbooniitti.
Suuraa yeroo dhugaatiif, seelonni jijjiiramaa sec31-1 ho'aaf miira qaban ijaarsa piroomootara GAL1 jalatti ibsan meediyaa YPR keessatti halkan tokkoof 24°C irratti hanga marsaa walakkaa log guddataniiru. YPG keessatti 24°C irratti sa’aatii 1f erga induction booda, seelonni SG keessatti 37°C irratti daqiiqaa 30f inkuubeer ta’aniiru, achiis gara 24°Ctti dabarfamee secretion block irraa gadhiifamaniiru. Konkaanaavaaliin A seelii islaayidii geejjibaa irratti sirreessuuf itti fayyadamee SCLIMn fakkii kaafame. SCLIM walnyaatinsa Olympus IX-71 inverted fluorescence microscope fi UPlanSApo 100×1.4 numerical aperture oil lens (Olympus), saffisa guddaa fi reeshiyoo mallattoo-sagalee olaanaa rotating disc confocal scanner (Yokogawa Electric), custom spectrometer, fi qabbanaa'uu amala The system's image intensifier (Hamamatsu Footoniksii) sirna leensii guddiftuu guddina dhumaa ×266.7 fi kaameraa meeshaa chaarjii-walqabsiifame kan elektiroonota baay’isu kennuu danda’a (Hamamatsu Photonics) (21). Fakkii argachuun kan raawwatamu sooftiweerii addaa (Yokogawa Electric) jedhamudha. Fakkiiwwan 3D tiif, leensii kaayyoo vertikaaliin raasuuf piezoelectric actuator akkaataa barbaadamuun hojjetame fayyadamne, kutaalee optikaalaa 100 nm addaan fagaatan tuullaa keessatti walitti qabne. Fakkiin Z-stack gara daataa voxel 3D tti kan jijjiiramu yoo ta’u, faankishiniin babal’ina qabxii ti’oorii maaykirooskooppii konfookaalii diskiin naanneffamuuf fayyadamu adeemsa deconvolution software Volocity (PerkinElmer) tiin fayyadama. Softiweeri Volocity fayyadamuun xiinxala bakka waliin jiruuf ofumaan ulaagaa (threshold) gochuun fe’umsa dabalatee ERES safarameera. Xiinxalli sarara iskaanii sooftiweeri MetaMorph (Molecular Devices) fayyadamuun raawwatameera.
Barbaachisummaa istaatiksii murteessuuf sooftiweeri GraphPad Prism fayyadamuu. Qormaata Student’s t-test funyaan lamaa fi qormaata idilee karaa tokkoon xiinxala garaagarummaa (ANOVA) tiif garaagarummaan gareewwan gidduu jiru P <0.05 (*) irratti dhiibbaa guddaa akka qabutti fudhatama.
Maaykirooskoopii fluorescence Gas1-GFP tiif, seelonni marsaa log YPD keessatti halkan tokkoof guddatanii seentiriifiigeeshiniin walitti qabamaniiru, soogidda fosfeetii baafaara ta'een yeroo lama dhiqaman, yoo xiqqaate daqiiqaa 15f bubbee irratti inkuubeer ta'aniiru, sana booda akka kanaan dura ibsametti maaykirooskooppii jalatti itti fufaniiru Check (24). Maayikirooskooppii Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) kan leensii objektiiwii, filtara L5 (GFP), kaameraa Hamamatsu fi sooftiweerii Application Suite X (LAS X) qabu argachuuf fayyadameera. .
Saamudaaleen SDS sample buffer 65°C irratti daqiiqaa 10f denatured, achiis SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) adda baafamaniiru. Xiinxala immunoblotting tiif, saamuda 10 μl daandii tokkotti fe’ameera. Farra qaama jalqabaa: Farra poliikloonii kanniisaa anti-Gas1 kanniisa 1:3000, kanniisaa poliikloonii farra Emp24 kanniisa 1:500, fi kanniisaa poliikloonii farra GFP (kennaa H. Riezman irraa) kanniisa 1:3000 fayyadamuu. Farri qaama hantuutaa monokloonal farra Pgk1 dilution 1:5000 (kennaa J. de la Cruz irraa) irratti fayyadameera. Farra qaama lammaffaa: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated re’ee farra kanniisaa immunoglobulin G (IgG) kan fayyadamu dilution 1:3000 (Pierce). HRP-conjugated re’ee farra hantuutaa IgG 1:3000 (Pierce) dilution fayyadameera. Zooniin deebii ittisa qaamaa mala keemilumineesansiin ri’ajantii SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) jedhamu fayyadamuun ilaalameera.
Akkuma (31) keessatti ibsametti, yaalii immunoprecipitation uumamaa firaakshinii ER badhaadhina qabu irratti raawwatameera. Gabaabumatti, seelii damma TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride fi protease inhibitor mixture) 600 nm ( OD600) irratti 100 optical density irratti yeroo lama dhiqachuu. Innis bifa geejjibaatiin kan cabe yoo ta’u, achiis caccabni seelii fi bifa geejjibaa seentiriifiigeeshiniin baafame. Sana booda supparnaataantiin 17,000 g irratti daqiiqaa 15f 4°C irratti seentirifuugii taasifamee ture. Peeleetiin TNE keessatti deebi’ee kan dhaabbate yoo ta’u, digitalis saponin ammoo gara qindoomina dhumaa %1tti itti dabalame. Suspension sa’aatii 1f naanneffamuu 4°C irratti kan inkuubeer ta’e, sana booda qaamoleen hin bulbulamne 13,000 g 4°C irratti daqiiqaa 60f seentiriifiigeeshiniin baafamaniiru. Gas1-GFP immunoprecipitation tiif, jalqaba saamuda agarose beads duwwaa (ChromoTek) waliin 4°C irratti sa’aatii 1f dursanii inkuubeer gochuu, achiis GFP-Trap_A (ChromoTek) waliin 4°C irratti sa’aatii 3f incubat gochuu. Biidiiwwan immunoprecipitated TNE 0.2% digoxigenin of keessaa qabuun yeroo shan dhiqaman, SDS sample buffer tiin eluted, SDS-PAGE irratti adda baafamanii, immunoblotting tiin xiinxalamaniiru.
Akkuma (31) keessatti ibsametti, murteen qaxxaamuraa firaakshinii ER badhaadhina qabu irratti raawwatameera. Gabaabumatti, firaakshiniin ER badhaadhina qabu 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, daqiiqaa 20) waliin inkuubeer ta’eera. Walnyaatinsi qaxxaamuraa gilsaayinii (50 mM qindoomina dhumaa, daqiiqaa 5, 20°C) dabaluudhaan dhaamfame.
Akkuma kanaan dura ibsame (50), xiinxalli MS seraamaayidii gosoota gosa bosonaafi GhLag1 keessatti raawwatameera. Gabaabumatti, seelonni YPD keessatti 30°C irratti gara marsaa eksaapooneenshiyaalii (3 hanga 4 OD600 units/ml)tti guddatan, seelonni 25×107 sassaabamaniiru. Meetaaboliizimiin isaanii asiidii tiraayikiloorooaseetikiin ni dhaamfama. Bulbulaa baasuu [etaanoolii, bishaan, iiteer, piriidiinii fi 4.2 N ammooniyeemii haayidirooksaayidii (15:15:5:1:0.018 v/v)] fi qulqullina keessoo istaandaardii C17 seraamaayidii (860517, Avanti polar lipid) 1.2 nmol fayyadamuu. Ri’ajantii monomethylamine [methanol, bishaan, n-butanol fi methylamine solution (4:3:1:5 v/v)] fayyadamuun alkaline haayidirooliizisii salphaa extract raawwachuu, achiis n-butanol bishaan guutuu fayyadamuun soogidda balleessuu. Dhumarratti, baafamni sun furdaa haala pozaatiivii [kilooroofoormii/meetaanoolii/bishaan (2:7:1) + 5 mM ammooniyeemii aseeteetii] keessatti deebi’ee dhaabbachuun gara ispeektiroomeetirii baay’inaan lilmoodhaan naqame. Hordoffiin walnyaatinsa hedduu (MRM) adda baasuu fi baay’ina molakiyuulota isfiingooliipidiitiif raawwatameera. TSQ Vantage tertiary quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) madda ayoon naannoo yaa’u roobootii Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) xiinxala lipidiitiif kan ooludha. Anniisaa walitti bu’iinsaa tokkoon tokkoon gosa seraamaayidiitiif kan mijatedha. Daataan MS haala pozaatiivii ta’een argameera. Tokkoon tokkoon baayoloojii baayoloojiidhaaf, mallattoon lipidii gidduugaleessa safartuuwwan of danda’an sadii ti.
Akkuma (31) keessatti ibsametti, seelonni (800×107) Gas1-GFP ibsan immunoprecipitation uumamaaf saaxilamaniiru. Gas1-GFP qulqullaa’e SDS-PAGEn adda baafamee gara meembraanii poliiviiniiliidiinii filooraayidii (PVDF)tti jijjiirame. Pirootiiniin kun PVDF amide black tiin faaluudhaan mul’ateera. Baandiin Gas1-GFP PVDF irraa muramee meetaanooliin yeroo 5 fi bishaan sadarkaa dhangala’aa kiroomaatoogiraafii-MS (LC-MS) tiin al tokko dhiqame. Meembraanii striip 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), baafaaraa fi 500μl makaa soodiyeem naayitraayitii 1 M haaraa bulbulame waliin 37°C irratti sa’aatii 3f inkuubeer gochuun, firaakshiniin lipidii Gas1-GFP irraa gadhiifamee lysed Release of inosine phosphate ceramide between glucosamine and inositol (51). Sana booda, striipiin meembraanii bishaan sadarkaa LC-MS tiin yeroo afur dhiqamee, ho’a kutaa keessatti gogfamee, hanga xiinxalaatti qilleensa naayitiroojiinii keessatti -80°C irratti kuufame. Akka to’annootti, tokkoon tokkoon yaaliitiif saamuda duwwaa meembraanii PVDF fayyadameera. Sana booda lipiidiin Gas1-GFP irraa baafame akka ibsametti MSn xiinxalame (50). Gabaabumatti, PVDF strips GPI-lipid of keessaa qaban 75μl negative mold solvent [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] keessatti deebi’anii suspended fi electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage) darbe. Haala kana keessatti, daataa MS haala ayoon negaatiivii ta’een argameera.
Akkuma armaan dura ibsame, kutaan lipidii GPI anchor [3H]-inositol-labeled GPI-AP irraa adda baafame ( 16 ). Lipiidonni sirna furdaa (55:45:10 kiloorofoormii-meetaanool-0.25% KCl) fayyadamuun kiroomaatoogiraafii laayibara haphiitiin adda baafamanii FLA-7000 (Fujifilm) fayyadamuun mul’ifamaniiru.
Seelonni Gas1-GFP (600×107) ibsan TNE baafaara TNE baafaariin yeroo lama dhiqamaniiru, fi bifa geejjibaatiin caccabaniiru, achiis caccabaa seelii fi biidiin geejjibaa balleessuuf seentirifuugii taasifamaniiru. Sana booda supparnaataantiin 17,000 g irratti sa’aatii 1f 4°C irratti seentirifuugii ta’e. Peeletiin TNE keessatti dhiqamee 1 U PI-PLC (Invitrogen) TNE 0.2% digitalis saponin of keessaa qabu keessatti sa’aatii 1f 37°C irratti inkuubeer ta’e. Wal’aansa inzaayimii booda, meembraanichi seentiriifiigeeshiniin 17,000 g 4°C irratti sa’aatii 1f baafame. Gas1-GFP immunoprecipitate gochuuf, supparnaataantiin GFP-Trap_A (ChromoTek) waliin halkan tokkoof 4°C irratti inkuubeer ta’e. Gas1-GFP qulqullaa’e SDS-PAGEn adda baafame Coomassie brilliant blue tiin faalameera. Baandiin faaluu Gas1-GFP halluu diimaa naannoo aqueduct irraa addaan cite, achiis erga iodoacetamide tiin alkylation fi dithiothreitol tiin hir'isuun booda, in-gel digestion with trypsin raawwatame. Peeptiidota tiriiptikii fi peeptiidota GPI-gilaayikaanota waliin baasuu fi gogsuu. Peeptiidiin goge bishaan 20 μl keessatti bulbulame. Kutaa tokko (8μl) LC keessatti lilmoodhaan naqa. Haala addaa giraadiyeentii jalatti peeptiidota adda baasuuf tarreen oktaadesiilsilaanii (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; daayameetira keessaa 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) fayyadameera. Marsaan socho’aa furdaa A (%0.08 asiidii foormiik) fi bulbulaa B (%0.15 asiidii foormiik %80 aseetoonitraayilii keessatti) dha. Sirni Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) fayyadamuun daqiiqaa 55 keessatti saffisa yaa’aa 50 μl min-1 daqiiqaa 5f furdaa A’n tarree kana dhiqachuuf, sana booda qindoominni furdaa B gara %40tti ol guddateera. , Yunaayitid Isteetis). Eluate madda ayoon ESI keessatti walitti fufiinsaan kan galfame yoo ta’u, peeptiidota tiriiptikii fi peeptiidonni GPI-gilaayikaanota qaban LTQ Orbitrap XL (hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific) tiin xiinxalamaniiru. Setup MS keessatti voolteejiin madda kaappilaarii 4.5 kV irratti kan kaa’ame yoo ta’u, ho’i kaappilaarii dabarsuu 300°C irratti eegameera. Voltaajiin kaappilaarii fi voolteejiin leensii tuubii akkaataa walduraa duubaan 15 V fi 50 V tti saagame. Daataan MS haala ayoon pozaatiivii (resolution of 60,000; mass accuracy of 10 parts per million) keessatti kan argame yoo ta’u, hamma ulfaatina 300/m/z reeshiyoo ulfaatinaa/chaarjii (m/z) 3000. Daataan MS/MS karaa kiyyoo ayoon LTQ Orbitrap XL [dijiitota 3 jalqabaa daataa irratti hundaa’e, walitti bu’iinsi addaan ba’uu fide keessatti argama (CID)) jedhu.
Fakkeenya MD sooftiweeri GROMACS (52) fi dirree humnaa MARTINI 2 (53-55) fayyadamuun raawwatameera. Sana booda CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) fayyadamuun bilayer dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) fi Cer C18 ykn DOPC fi Cer C26 of keessaa qabu ijaareera. Toopoloojii fi koordineetonni Cer C26 DXCE irraa kan argaman biidiiwwan dabalataa funyaan isfiingoosiinii irraa baasuudhaani. Adeemsa armaan gaditti ibsame fayyadamuun laayibara dachaa madaaluu fi hojjedhu, sana booda qindeessoota dhumaa sirnichaa fayyadamuun sirna Emp24 of keessaa qabu ijaari. Domeeniin transmembrane damma Emp24 (haftee 173 hanga 193) akka α-helix meeshaa mul'ataa MD (VMD) caasaa molakiyuulaa fayyadamuun ijaarame ( 58 ). Sana booda, lipiidota wal-irratti argaman erga buqqisanii booda pirootiinichi akka gurguddaatti granulated ta’ee CHARMM GUI fayyadamuun bilayer keessa galfame. Sirni dhumaa DOPC 1202 fi Cer C26 302 ykn DOPC 1197 fi Cer C18 fi Emp24 295 of keessaa qaba. Sirnicha gara qindoomina 0.150M tti ayoonii gochuu. Fakkeenyonni of danda’an afur walnyaatinsa bilayer lamaaf hojjetameera.
Lipid bilayer adeemsa CHARMM GUI fayyadamuun madaalawaadha, kunis tarkaanfiiwwan 405,000 xiqqeessuu fi sana booda madaaluu kan of keessaa qabu yoo ta’u, bakka danqaan iddoo suuta suutaan hir’atee fi dhabamsiifamu, tarkaanfiin yeroo 0.005 ps irraa gara 0.02 ps tti ol guddata. Erga walmadaalchisee booda tarkaanfii yeroo 0.02 ps ta’een 6 μs oomisha. Erga Emp24 galchitee booda, adeemsa CHARMM GUI walfakkaatu fayyadamuun sirnicha xiqqeessuu fi madaaluu, sana booda oomisha keessatti s 8 fiigi.
Sirnoota hundaaf adeemsa madaallii keessatti dhiibbaan kan to’atamu Berendsen barostat (59) yoo ta’u, adeemsa oomishaa keessatti dhiibbaan kan to’atamu Parrinello-Rahman barostat (60) dha. Haala hunda keessatti dhiibbaan giddugaleessaa 1 bar yoo ta’u, iskiimiin walqabsiisa dhiibbaa walakkaa isotropic fayyadama. Adeemsa madaallii fi oomishaa keessatti, termostaatii (61) saffisa irra deebiin safaruu qabu, teempireechara pirootiinii, lipidii fi furdaa paartiikilii wal duraa duubaan walqabsiisuuf fayyadama. Yeroo hojii guutuu ho'i galma ta'e 310K dha. Wal-nyaatinsi hidhoo hin taane kan shallagamu tarree wal-fuudhii iskiimii Verlet fayyadamuun obsa baafaaraa 0.005 qabu maddisiisuudhaani. Tarmiin Kuuloom dirree walnyaatinsaa fi fageenya kutaa 1.1 nm fayyadamuun shallagama. Jechi Vander Waals skiimii kutaa fageenya kutaa 1.1 nm qabu fayyadama, akkasumas skiimiin kutaa Verlet potential drift (62) fayyadama.
VMD fayyadamuun, dheerinni dalgee kutaa DOPC phosphate beads ykn ceramide AM1 beads fi pirootiinii gidduu jiru 0.7 nm yoo ta’u, baay’inni lipiidota pirootiinii wajjin walnyaatan shallagama. Akka foormulaa armaan gadiitiin, akka (63) keessatti ibsametti, factor depletion-enrichment (DE) shallagi: DE factor = (hamma lipiidota waliigalaa pirootiinii keessatti 0.7) pirootiinii 0.7 keessatti (hamma Cer lipiidota waliigalaa keessatti) .
Gatiin gabaafame akka giddugaleessaatti kan argamu yoo ta’u, barruulee dogongoraa kooppii of danda’e afur SE dha. Barbaachisummaan istaatiksii DE factor qorannoo t [(averageDE-factor-1)/SE] tiin shallagama. Gatii P raabsa funyaan tokkoo irraa shallagi.
Meeshaan GROMACS kaartaa dhangala’aa cinaachaa 2D sirna Emp24 of keessaa qabu ns 250 dhumaa hordoffii keessatti shallaguuf itti fayyadameera. Kaartaa badhaadhina/hir’ina seraamaayidii argachuuf kaartaan dhangala’aa Cer walitti qabama kaartaa Cer fi DOPCn qoodama, achiis qindoomina Cer qaama keessatti argamuun qoodama. Iskeeliin kaartaa halluu walfakkaataan fayyadama.
Barreeffama kanaaf meeshaalee dabalataa argachuuf, maaloo http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 ilaalaa
Kun barruu banaa ta’ee fi haala hayyama Creative Commons Attribution-Non-Commercial License jalatti raabsame yoo ta’u, kunis itti fayyadamni dhumaa bu’aa daldalaaf kan hin taanee fi yaadni isaa hojiin jalqabaa sirrii ta’uu isaa hanga ta’etti, meeshaa kamiinuu itti fayyadamuu, raabsuu fi baay’isuu kan hayyamu dha. Wabeeffannaa.
Hubachiisa: Namni ati fuula sanaaf gorsitu email sana akka argu akka barbaadduu fi spam akka hin taane akka beekuuf qofa teessoo email kee akka kennitu qofa si gaafanna. Teessoo email kamiyyuu hin qabannu.
Gaaffiin kun daawwataa ta'uu kee qorachuu fi ofumaan spam akka hin dhiyaanne ittisuuf kan gargaarudha.
Soofiyaa Roodriigeez-Gallardoo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Vaaleria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waagaa), Miisaakoo Armaan (Misaakoo Armaan), Miyaakoo Riimaan (Miyaakoo Rimaan), Piroow Akiraa, Isteefanoo Faaniin, Akiihiikoo Naakaanoo, Maanu'eel Muuniiz
Suuraan yeroo dhugaa 3D qulqullina olaanaa qabu barbaachisummaa dheerina sansalata seraamaayidii pirootiinii sassaabuu iddoowwan oomisha filannoo keessatti mul'isa.
Soofiyaa Roodriigeez-Gallardoo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Vaaleria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waagaa), Miisaakoo Armaan (Misaakoo Armaan), Miyaakoo Riimaan (Miyaakoo Rimaan), Piroow Akiraa, Isteefanoo Faaniin, Akiihiikoo Naakaanoo, Maanu'eel Muuniiz
Suuraan yeroo dhugaa 3D qulqullina olaanaa qabu barbaachisummaa dheerina sansalata seraamaayidii pirootiinii sassaabuu iddoowwan oomisha filannoo keessatti mul'isa.
©2020 Waldaa Guddina Saayinsii Ameerikaa. mirgi hunduu kan eegamedha. AAAS michuu HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef fi COUNTER ti. Guddina Saayinsii ISSN 2375-2548.