Barreeffamni kun qaama mata duree qorannoo “Ittaa ittisa legumes paatojeenotaa fi raammoo fooyyessuu” jedhu yoo ta’u, barreeffamoota 5 hunda ilaali
Sababni dhukkuba biqiltoota fangasii nekroosii Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary biqiltoota keessummeessitoota adda addaa faaluuf tooftaa sadarkaa hedduutti fayyadama. Qorannoon kun deebii molakiyuulaa, fiiziyoloojii fi baayookeemikaalaa Phaseolus vulgaris L. boca adii Pseudomonas sclerotiorum tiin dhufu guddisuuf akka tooftaa bulchiinsa filannootti fayyadamuu diamine L-ornithine, amino acid pirootiinii hin taane kan walnyaatinsa amiinoo asiidota barbaachisoo biroo kakaasu yaada dhiheessa. Yaalii in vitro akka agarsiisutti L-ornithine guddina mycelial S. pyrenoidosa haala doosiin hirkateen haalaan dhorke. Kana malees, haala mana magariisaa keessatti hamma boca adii haalaan hir’isuu danda’a. Kana malees, L-ornithine guddina biqiltoota wal’aanamanii kan kakaase yoo ta’u, kunis qindoominni L-ornithine qoratame biqiltoota wal’aanamaniif faayitootoksiikii akka hin taane agarsiisa. Dabalataanis, L-ornithine ibsa antioksidaantota inzaayimii hin taane (waliigalatti bulbulamoo feenooliikii fi flaavonoids) fi antioksidaantoota inzaayimii (catalase (CAT), peroxidase (POX), fi polyphenol oxidase (PPO)) guddiseera, akkasumas ibsa jiiniiwwan antioksidaantii waliin walqabatan sadii (PvCAT1, PvSOD, fi PvGR) dabaleera. Kana malees, xiinxalli in silico pirootiiniin oksalooaseeteetii aseetiilhayidirooleesii (SsOAH) jedhame jiinooma S. sclerotiorum keessatti argamuun isaa pirootiinota oksalooaseeteetii aseetaayiliihayidirooleesii (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) fi Penicillium sp. (PlOAH) gama xiinxala dalagaa, domeenii kunuunfame, fi toopoloojiitiin. Kan nama ajaa’ibu, L-ornithine meediyaa boqqolloo dextrose broth (PDB) irratti dabalamuun ibsa jiini SsOAH S. sclerotiorum mycelia keessatti haalaan hir’ise. Haaluma walfakkaatuun, L-ornithine exogenous fayyadamuun ibsa jiini SsOAH maayseelii fangasii biqiltoota wal’aanamaa irraa walitti qabaman keessatti haalaan hir’ise. Dhumarratti, L-ornithine fayyadamuun baala PDB medium fi dhukkuba kanaan qabame keessatti dhangala’aa asiidii oksaalikii haalaan hir’ise. Xumura irratti, L-ornithine haala redox eeguu akkasumas deebii ittisa biqiltoota dhukkuba kanaan qabaman guddisuu keessatti gahee olaanaa qaba. Bu’aan qorannoo kanaa mala kalaqaa, naannoodhaaf mijatu kan boca adii to’achuu fi dhiibbaa inni oomisha baaqelaa fi midhaan biroo irratti qabu salphisuuf gargaaruu danda’a.
Boca adiin, fangasii necrotrophic Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary irraa kan dhufu yoo ta’u, dhukkuba hamaa, oomisha hir’isuu fi oomisha baaqelaa addunyaa (Phaseolus vulgaris L.) irratti balaa guddaa fiduudha (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum paatojeenoota biqiltoota fangasii biyyee irraa daddarban to’achuun rakkisaa ta’an keessaa tokko yoo ta’u, keessummeessitoota bal’aa gosoota biqiltoota 600 ol ta’anii fi dandeettii tishuuwwan keessummeessituu haala adda hin taane saffisaan macerate gochuu qaba (Liang and Rollins, 2018). Haala mijataa hin taane keessatti marsaa jireenya isaa keessatti marsaa murteessaa ta’e keessa darba, yeroo dheeraaf akka caasaa gurraacha, jabaa, sanyii fakkaatu biyyee keessatti ‘sclerotia’ jedhamutti ykn akka guddina adii, lilmoo biqiltoota dhukkuba kanaan qabaman keessatti maayseeliyeemii ykn stem pith keessatti rafee jiraata (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum sclerotia uumuu kan danda’u yoo ta’u, kunis dirree dhukkuba kanaan qabame keessatti yeroo dheeraaf akka jiraatu fi yeroo dhukkubaa akka itti fufu isa dandeessisa (Schwartz et al., 2005). Iskileerootiyaan soorataan kan badhaadhe yoo ta’u, yeroo dheeraaf biyyee keessatti turuu kan danda’u yoo ta’u, infekshiniiwwan booda dhufaniif akka talaallii jalqabaatti tajaajilu (Schwartz et al., 2005). Haala mijataa keessatti, iskileerotiyaa biqilee ispoorota qilleensa keessaa kan uumu yoo ta’u, kunis daraaraa, hidda, ykn qodaa dabalatee kutaalee biqiltuu lafa irraa hunda faaluu danda’a (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum biqiltoota keessummeessitoota isaa faaluuf tooftaa sadarkaa hedduu qabu fayyadama, kunis taateewwan qindoomina qaban walduraa duubaan biqiluu iskileerooshiyaa irraa kaasee hanga guddina mallattootti raawwataman of keessatti qabata. Jalqaba irratti S. sclerotiorum caasaa mushroom fakkaatu kan apothecia jedhamu irraa ispoorota dhaabbate (ascospores jedhaman) kan uumu yoo ta’u, isaanis qilleensa keessaa ta’anii caccabaa biqiltoota dhukkuba kanaan qabaman irratti gara iskileerotiyaa hin sochooneetti guddatu (Bolton et al., 2006). Sana booda fangasichi asiidii oksaalik, sababa vaayirasii ta’e, pH dallaa seelii biqiltootaa to’achuuf, manca’iinsa inzaayimii fi weerara tishuu guddisuuf (Hegedus and Rimmer, 2005), fi dho’iinsa oksijiinii biqiltuu keessummeessituu ukkaamsuuf dhangalaasa. Adeemsi asiidii ta’uu kun dallaa seelii biqiltootaa kan dadhabsiisu yoo ta’u, hojii idilee fi gahumsa qabu kan inzaayimoota dallaa seelii fangasii (CWDEs) ta’aniif haala mijataa ta’e kan kennu yoo ta’u, kunis paatojeeniin kun danqaa fiizikaalaa akka mo’atee tishuuwwan keessummeessituu keessa akka seenu taasisa (Marciano et al., 1983). S. sclerotiorum erga seenee booda CWDE baay’ee kan akka polygalacturonase fi cellulase kan dhangalaasu yoo ta’u, kunis tishuuwwan dhukkuba kanaan qabaman keessatti akka babal’atu kan mijeessanii fi tissue necrosis kan fidan dha. Guddinni madaa fi hyphal mats mallattoolee amala boca adii fida (Hegedus and Rimmer, 2005). Gama biraatiin, biqiltoonni keessummeessitootaa karaa fudhatoota paateeniin beekamtii (PRRs) paatennoota molakiyuulaa paatojeeniin walqabatan (PAMPs) beeku, kunis taateewwan mallattoo walduraa duubaan kan dhuma irratti deebii ittisaa kakaasan kakaasu.
Tattaaffiin to’annoo dhukkubaa waggoota kurnan lamaan darbaniif godhamus, hanqinni jarmii pilaasmii gahaa dandamachuu danda’u akkuma midhaan daldalaa biroo, sababa dandeettii dhukkuba kana ofirraa ittisuu, lubbuun jiraachuu fi madaqsuu danda’uu isaatiin baaqelaa keessattis hafeera. Kanaafuu bulchiinsi dhukkubaa garmalee qormaata waan ta’eef tooftaa walitti makamaa, kallattii hedduu qabu kan walnyaatinsa gochaalee aadaa, to’annoo baayoloojii, fi qoricha fangasii keemikaalaa of keessatti hammate barbaada (O’Sullivan et al., 2021). To’annoo keemikaalaa boca adii hunda caalaa bu’a qabeessa sababiin isaas qorichi fangasii sirritti fi yeroo sirrii ta’etti yoo dibame tamsa’ina dhukkubichaa haala bu’a qabeessa ta’een to’achuu, hamma infekshinii hir’isuu fi kasaaraa oomishaa xiqqeessuu danda’a. Haa ta’u malee, garmalee fayyadamuun fi garmalee fanjiisiidii irratti hirkachuun gosoota S. sclerotiorum dandamatan akka uumamuu fi orgaanizimoota galma hin taane, fayyaa biyyee, fi qulqullina bishaanii irratti dhiibbaa hamaa geessisuu danda’a (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Kanaaf, filannoowwan naannoodhaaf mijatoo ta’an argachuun hojii dursaa ta’eera.
Polyamines (PAs), kan akka putrescine, spermidine, spermine, fi cadaverine, akka filannoo abdachiisaa ta’ee paatojeenoota biqiltoota biyyee keessaa daddarban irratti tajaajiluu danda’u, kanaanis guutummaatti ykn gartokkoon itti fayyadama keemikaala fangasii balaafamaa hir’isuu danda’a (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Biqiltoota ol’aanoo keessatti, PAn adeemsa fiiziyoloojii hedduu keessatti hirmaatu, garuu kanneen kanaan hin daangeffamne, qoqqoodinsa seelii, addaan baafamuu, fi deebii dhiibbaa abiyootikii fi baayootikii (Killiny and Nehela, 2020). Isaan akka antioxidants ta’anii hojjechuu danda’u, gosoota oksijiinii deebii kennan (ROS) haguuguuf gargaaruu, homeostasis redox eeguu (Nehela and Killiny, 2023), jiiniiwwan ittisa waliin walqabatan kakaasuu (Romero et al., 2018), karaa meetaabolii adda addaa to’achuu (Nehela and Killiny, 2023), endogenous phytohormones (Nehela and Killiny, 2023) jijjiiruu danda’u. 2019), dandeettii ittisa sirnaa argate (SAR) hundeessu, fi wal-nyaatinsa biqiltootaa fi paatojeenii ni to’atu (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Malli addaa fi gaheen PAn ittisa biqiltootaa keessatti qaban gosa biqiltootaa, paatojeenoota, fi haala naannoo irratti hundaa’uun garaagarummaa akka qabu hubatamuu qaba. PA biqiltoota keessatti baay’inaan argamu kan baayoosintesis ta’e barbaachisaa polyamine L-ornithine irraati (Killiny and Nehela, 2020).
L-ornithine guddinaa fi guddina biqiltootaa keessatti gahee dachaa qaba. Fakkeenyaaf, qorannoowwan kanaan duraa akka agarsiisanitti, ruuzii (Oryza sativa) keessatti, ornithine naayitiroojiinii deebi’ee fayyadamuu (Liu et al., 2018), oomisha ruuzii, qulqullinaa fi urgooftuu (Lu et al., 2020), fi deebii dhiibbaa bishaanii (Yang et al., 2000) wajjin walqabatee jiraachuu danda’a. Kana malees, L-ornithine exogenous fayyadamuun gogiinsa dandamachuu sukkaara biiti (Beta vulgaris) keessatti haalaan guddiseera (Hussein et al., 2019) fi dhiibbaa soogidda basaqaa (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu fi Çavuşoǧlu, 2021) fi kaashuu (Anacardium occidentale) keessatti salphiseera. biqiltoota (da Rocha fi kkf, 2012). Gaheen L-ornithine ittisa dhiibbaa abiyootikii keessatti qabaachuu danda’u biqiltoota wal’aanamanii keessatti kuufama pirooliinii keessatti hirmaannaa isaa irraa kan ka’e ta’uu danda’a. Fakkeenyaaf, jiiniiwwan meetaabolii piroolinii wajjin walqabatan, kanneen akka ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) fi proline dehydrogenase (ProDH1 fi ProDH2) jiiniiwwan, kanaan dura ittisa Nicotiana benthamiana fi Arabidopsis thaliana gosoota Pseudomonas syringae keessummeessituu hin taane (Senthil-Kumar fi Maaysoorii, 2012). Gama biraatiin guddina paatojeeniif fangasii ornithine decarboxylase (ODC) barbaachisa (Singh et al., 2020). ODC Fusarium oxysporum irratti xiyyeeffachuu f. sp. lycopersici karaa host-induced gene silencing (HIGS) biqiltoonni timaatima Fusarium wilt dandamachuu isaanii haalaan guddiseera (Singh et al., 2020). Haa ta’u malee, gaheen fayyadama ornithine exogenous dhiibbaa baayootikii kan akka phytopathogens irratti qabaachuu danda’u akka gaariitti hin qoratamne. Kan caalu ammoo, dhiibbaan ornithine dandeettii dhukkuba ofirraa ittisuu fi taateewwan baayookeemikaalaa fi fiiziyoloojii kanaan walqabatan baay’inaan hin qoratamne.
Walxaxiinsa infekshinii S. sclerotiorum kan legumes hubachuun tooftaalee to’annoo bu’a qabeessa ta’an qopheessuuf barbaachisaa dha. Qorannoon kun, gahee diyaamiinii L-ornithine mala ittisaa fi dandeettii ittisa biqiltoonni legume infekshinii Sclerotinia sclerotiorum guddisuu keessatti akka waan ijootti qabaachuu danda’u adda baasuuf kaayyeffanneerra. Nu tilmaamna, deebii ittisa biqiltoota dhukkuba kanaan qabaman guddisuu bira darbee, L-ornithine haala redox eeguu keessattis gahee ijoo qaba. Nu bu'aan L-ornithine ta'uu danda'u dambii mala ittisa antioksidaantii inzaayimii fi inzaayimii hin taane fi gidduu seenummaa fangasii pathogenicity / vaayirasii sababoota fi pirootiinota walqabatan waliin walqabatee akka ta'e yaada dhiheessina. Hojiin dachaa L-ornithine kun dhiibbaa boca adii salphisuu fi dandeettii midhaan legume waliigalaa paatojeenii fangasii cimaa kana guddisuuf tooftaa itti fufiinsa qabuuf kaadhimamaa abdachiisaa isa taasisa. Bu’aan qorannoo ammaa kun mala kalaqaa, naannoodhaaf mijaawaa ta’e kan boca adii to’achuu fi dhiibbaa inni oomisha legume irratti qabu salphisuuf gargaaruu danda’a.
Qorannoon kun gosti baaqelaa waliigalaa daldalaaf saaxilamu Giiza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) akka meeshaa yaaliitti fayyadameera. Sanyiiwwan fayya qabeessa ta’an gaarummaadhaan Kutaa Qorannoo Legume, Inistiitiyuutii Qorannoo Midhaan Dirree (FCRI), Giddugala Qorannoo Qonnaa (ARC), Gibxiin kennameera. Sanyiiwwan shan haala mana magariisaa (25 ± 2 °C, jiidhinni walqabataa 75 ± 1%, ifa sa’aatii 8/sa’aatii 16 dukkana) keessatti biyyee S. sclerotiorum-in faalameen guutame keessatti facaafamaniiru. Facaasanii guyyoota 7-10 booda (DPS) biqiltuun tokkoon tokkoon qodaa keessatti biqiltuu lama qofa guddina walfakkaataa fi baala guutummaatti babal’ate sadii qofa akka hafan qalla’aniiru. Biqiltoonni suphee keessa jiran hundi torban lamatti al tokko bishaan itti naqanii ji’a ji’aan gosa kennameef saffisa gorfameen xaa’oo ta’aniiru.
L-ornithinediamine ((+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid jedhamuunis beekama; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) 500 mg/L qopheessuuf, jalqaba 50 mg bishaan distilled sterile 100 mL keessatti bulbulame. Sana booda furmaanni istookii sun diilalla’ee yaalii itti aanu keessatti itti fayyadameera. Gabaabumatti, tartiiba ja’a kan L-ornithine concentrations (12.5, 25, 50, 75, 100, fi 125 mg/L) in vitro qoratameera. Kana malees, bishaan distilled sterile akka to’annoo negaatiiviitti (Mock) kan fayyadame yoo ta’u, fangasii daldalaa “Rizolex-T” 50% budaa jiidhamuu danda’u (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) akka to’annoo pozaatiiviitti fayyadameera. Faanjiisaayidii daldalaa “Rizolex-T” in vitro keessatti qindoomina shan (2, 4, 6, 8 fi 10 mg/L) irratti qoratameera.
Saamuda hidda baaqelaa waliigalaa fi podiiwwan mallattoolee addaa boca adii agarsiisan (saffisa weerara: 10–30%) qonna daldalaa irraa walitti qabameera. Meeshaaleen biqiltootaa dhukkuba kanaan qabaman irra caalaan isaanii gosa/gosa (gosa daldalaaf saaxilamoo Giiza 3) adda baafamanis, kaan, keessumaa kanneen gabaa naannoo irraa argaman, gosa hin beekamne turan. Meeshaaleen dhukkuba kanaan qabaman walitti qabaman jalqaba furmaata soodiyeem haaypooklooraayitii %0.5n daqiiqaa 3f fuula irraa disinfected, sana booda bishaan distilled sterile ta’een yeroo hedduu dhiqamee waraqaa filtara sterile ta’een gogfamee bishaan garmalee balleessuuf. Sana booda qaamoleen dhukkuba kanaan qabaman tishuuwwan giddugaleessaa irraa (tishuuwwan fayyaa fi dhukkuba kanaan qabaman gidduutti) xixiqqootti muramanii, meediyaa boqqolloo deekstroosii agar (PDA) irratti aadaa godhachuun marsaa ifaa h 12/sa’aatii 12 dukkanaa waliin guyyoota 5f 25 ± 2 °C irratti inkuubeer ta’uun uumamuu iskileerooshiyaa kakaafamaniiru. Akkasumas mala fiixee maayseelii aadaa makaa ykn faalame irraa fangasii adda baafame qulqulleessuuf itti fayyadameera. Foonjii adda baafame qulqullaa’e jalqaba amala morfoloojii aadaa isaa irratti hundaa’uun adda baafamee booda amala maaykirooskoopii irratti hundaa’uun S. sclerotiorum ta’uun isaa mirkanaa’eera. Dhumarratti, adda baafamtoonni qulqullaa’an hundinuu yaada Koch guutuuf gosa baaqelaa waliigalaa saaxilamoo Giza 3 irratti dhukkuba uumuu isaanii qoratameera.
Kana malees, S. sclerotiorum isolate (isolate #3) kan baay’ee weerartuu ta’e akka White et al., 1990 ibsanitti tartiiba internal transcribed spacer (ITS) irratti hundaa’uun daran mirkanaa’eera; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Gabaabumatti, adda baafaman boqqolloo deekstroosii broth (PDB) keessatti aadaa fi 25 ± 2 °C irratti guyyoota 5-7f inkuubeer. Sana booda maayisiliyeemiin fangasii walitti qabamee, huccuu daabboo keessaa calalamee, bishaan sterile ta’een si’a lama dhiqamee, waraqaa calaqqee sterile ta’een gogfame. DNAn jiinoomii Quick-DNATM Fungal/Bacterial Miniprep Kit fayyadamuun adda baafameera (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Naannoon rDNA ITS sana booda lamaan priimerii addaa ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; guddina eegamu: 540 bp) fayyadamuun guddate ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Oomishaaleen PCR qulqullaa’an tartiibaaf dhiyaataniiru (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Tartiibonni rDNA ITS mala tartiiba Sanger fayyadamuun kallattii lamaatiin tartiiba qabamaniiru. Sana booda tartiiba gaaffii walitti qabame daataa haaraa GenBank fi Giddugala Odeeffannoo Baayooteknooloojii Biyyaalessaa (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) keessatti argamu waliin sooftiweeri BLASTn fayyadamuun walbira qabamee ilaalameera. Tartiiba gaaffii gosoota/addaan baafaman S. sclerotiorum biroo 20 kanneen daataa haaraa NCBI GenBank (Gabatee Dabalataa S1) keessatti argaman irraa ClustalW fayyadamuun Paakeejii Xiinxala Jeneetiksii Jijjiirama Molecular (MEGA-11; version 11) keessatti walbira qabamee ilaalameera (Kumar et al., 2024). Xiinxalli jijjiirama tirannaa mala carraa guddaa fi moodeela bakka bu’iinsa niwuukilootaayidii waliigalaa yeroon duubatti deebi’uu danda’u fayyadamuun raawwatameera (Nei and Kumar, 2000). Mukti log-likelihood ol'aanaa qabu agarsiifama. Mukti jalqabaa barbaacha heuristic muka muka ollaa-walitti makamuu (NJ) (Kumar et al., 2024) fi muka maximum parsimony (MP) gidduutti log-likelihood ol’aanaa qabu filachuudhaan filatama. Mukti NJ kan ijaarame maatiriksii fageenya lama lamaa kan moodeela waliigalaa yeroon duubatti deebi’uu danda’u fayyadamuun shallagame fayyadamuun ture (Nei and Kumar, 2000).
Sochiin farra baakteeriyaa L-ornithine fi baakteeriyaa ajjeesu “Rizolex-T” mala agar diffusion tiin in vitro keessatti murtaa’eera. Mala: Hamma barbaachisaa ta’e furmaata istookii L-ornithine (500 mg/L) fudhachuun meediyaa soorataa PDA 10 ml waliin sirriitti walitti makuun furmaata qindoomina dhumaa 12.5, 25, 50, 75, 100 fi 125 mg/L ta’e qopheessuu. Akka to’annootti qindoominni fangasii “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 fi 10 mg/L) fi bishaan distiilii sterile ta’e shan fayyadameera. Erga meediyaan sun jabaatee booda, pilaagiin maayseelii haaraa qophaa’e aadaa Sclerotinia sclerotiorum, daayameetira mm 4 qabu, gara wiirtuu saanii Petritti dabarfamee hanga maayseeliyeemiin guutummaa saanii to’annoo Petri dish uwwisutti 25±2°C irratti guddifame, sana booda guddinni fangasii galmaa’e. Hima walqixaa 1 fayyadamuun guddina raadiyaalii S. sclerotiorum dhibbeentaa dhorkuu shallagi:
Yaalii yeroo lama irra deebi’amee kan raawwatame yoo ta’u, tokkoon tokkoon garee to’annoo/yaaliif baayoloojii ja’a fi tokkoon tokkoon baayoloojii baayoloojiidhaaf qodaa shan (qodaa tokkoof biqiltoota lama) qaba. Tokkoon tokkoon fakkeessuu baayoloojii yeroo lama (fakkeessuu teeknikaa lama) xiinxalamee bu’aa yaalii sirrii ta’uu, amanamummaa fi deebi’ee kan hojjetamu ta’uu isaa mirkanaa’eera. Kana malees, xiinxala probit regression fayyadamee walakkaa ol’aanaa inhibitory concentration (IC50) fi IC99 (Prentice, 1976) shallagameera.
Haala mana magariisaa jalatti dandeettii L-ornithine madaaluuf yaalii qodaa lama walitti aansuun gaggeeffameera. Gabaabumatti, qodaa biyyee suphee-cirracha sterilize ta’een (3:1) guutamee aadaa S. sclerotiorum haaraa qophaa’een talaalameera. Tokkoffaa, adda baafame S. sclerotiorum (isolate #3) kan baay’ee weerartuu ta’e, sclerotium tokko walakkaatti muruudhaan, fuula isaa gadi PDA irratti kaa’ee fi dukkana dhaabbataa (24 h) keessatti guyyoota 4f 25°C irratti inkuubeer gochuun guddina mycelial kakaasuun aadaa godhame. Sana booda pilaagiin agar daayameetira mm 5 qabu afur qarqara duraa irraa fudhatamee makaa qamadii fi qamadii ruuzii 100 g sterile (1:1, v/v) tiin talaalamanii fi flaskoonni hundi marsaa ifa sa’aatii 12/sa’aatii 12 dukkanaa jalatti guyyoota 5f 25 ± 2 °C irratti inkuubeer ta’uun uumamuu iskilirootiyaa kakaafamaniiru. Qabiyyeen fiilaskioota hunda biyyee itti dabaluun dura walfakkeenya mirkaneessuuf sirriitti walitti makame. Sana booda, tokkoon tokkoon qodaa irratti makaa qamadii koloneeffataa 100 g itti dabalamee, qindoomina paatojeenotaa dhaabbataa ta’e mirkaneessuuf. Supheewwan talaalamanii guddina fangasii akka sochoosuuf bishaan itti naqanii haala mana magariisaa keessa guyyoota 7f kaa’amaniiru.
Sana booda sanyiiwwan gosa Giiza 3 shan tokkoon tokkoon qodaa keessatti facaafaman. Supheewwan L-ornithine fi fangasiidii Rizolex-T tiin wal’aanamaniif, sanyiiwwan sterilize ta’an jalqaba sa’aatii lamaaf furmaata bishaanii kompaawundoota lamaan keessatti IC99 dhumaa gara 250 mg/L fi 50 mg/L, akkaataa wal duraa duubaan jiruun jiidhee, sana booda facaasuun dura sa’aatii tokkoof qilleensaan gogfamaniiru. Gama biraatiin sanyiiwwan akka to’annoo negaatiiviitti bishaan distiilii sterile keessatti jiidhamaniiru. Guyyaa 10 booda, bishaan jalqabaa osoo hin obaasin dura, biqiltuun sun qallachuun, tokkoon tokkoon qodaa keessatti biqiltuu sirrii lama qofatu hafe. Dabalataanis, infekshinii S. sclerotiorum mirkaneessuuf, hiddi biqiltoota baaqelaa sadarkaa guddinaa walfakkaataa (guyyoota 10) irratti bakka adda addaa lamatti scalpel sterilized fayyadamuun muramee, tilmaamaan 0.5 g makaa bran koloneeffataa tokkoon tokkoon madaa keessa kaa’amee, itti aansuudhaan jiidhinni olaanaan biqiltoota talaalamanii hunda keessatti infekshinii fi guddina dhukkubaa kakaaseera. Biqiltoonni to’annoo haala walfakkaatuun madaa’aniiru, makaan qamadii sterile, koloneeffame hammi walqixa (0.5 g) madaa keessa kaa’amee jiidhina olaanaa jalatti eegamee naannoo guddina dhukkubaa fakkeessuu fi gareewwan wal’aansaa gidduutti walsimsiisummaa mirkaneessuuf.
Mala wal’aansaa: Biqiltoonni baaqelaa biyyee jallisiidhaan bishaan L-ornithine (250 mg/l) ykn fangasiidii Rizolex-T (50 mg/l) 500 ml bishaan itti naquudhaan, sana booda wal’aansi kun guyyoota 10 gidduutti yeroo sadii irra deebi’ameera. To’attoonni pilaasboodhaan wal’aanamanii bishaan distiilii sterile 500 ml jallisiifamaniiru. Wal’aansi hundi haala mana magariisaa (25 ± 2°C, 75 ± 1% jiidhina firaakshinii, fi yeroo footo 8 h ifa/16 h dukkanaa) jalatti raawwatame. Supheen hundinuu torban lama lamatti bishaan obaafamanii akkaataa yaada gosa addaa fi qajeelfama oomishtootaatiin xaa’oo NPK madaalawaa (20-20-20, salfarii fi TE microelements %3.6; Zain Seeds, Egypt) tiin qindoomina 3–4 g/l ta’een baala biifamuun wal’aanamaa turan. Yoo haala biraatiin ibsame malee, baalli bilchaataa guutummaatti babal’ate (baalli 2ffaa fi 3ffaa gubbaa irraa) tokkoon tokkoon fakkaattota baayoloojii irraa sa’aatii 72 booda wal’aansa booda (hpt) walitti qabame, homogenized, pooled fi -80 °C irratti kuufame xiinxala dabalataa dabalatee, garuu kanneen kanaan hin daangeffamne, in situ histochemical localization of oxidative stress indicators, lipid peroxidation, enzymatic and non-enzymatic antioxidants fi ibsa jiinii.
Ciminni infekshinii boca adii torbanitti guyyoota 21 booda talaallii (dpi) iskeelii 1–9 (Gabatee Dabalataa S2) fayyadamuun iskeelii Petzoldt fi Dickson (1996) Teran et al. (2006) tiin kan qophaa’e. Gabaabumatti, adeemsa madaa internoodii fi noodiiwwan irratti hordofuuf, hiddaa fi damee biqiltoota baaqelaa bakka talaallii irraa eegalee qoratameera. Fageenyi madaa bakka talaallii irraa kaasee hanga bakka fagootti hundee ykn damee irratti argamu sana booda safaramee bakka madaan sun jiru irratti hundaa’uun qabxiin 1–9 ramadame, (1) bakka talaallii sanatti dhihoo infekshiniin mul’atu akka hin jirre kan agarsiisu yoo ta’u (2–9) ammoo guddinni madaa fi guddinni noodota/internoodii irratti suuta suutaan dabaluu agarsiisa (Gabatee Dabalataa S2). Sana booda ciminni infekshinii boca adii foormulaa 2 fayyadamuun gara dhibbeentaatti jijjiirame:
Kana malees, naannoon kaarvii guddina dhukkubaa jala jiru (AUDPC) foormulaa (Shaner and Finney, 1977) fayyadamuun shallagameera, kunis dhiheenya kana walqixxaattoo 3 fayyadamuun marga adii baqalaa waliigalaa (Chauhan et al., 2020) tiif kan madaqfame yoo ta’u:
Bakka Yi = cimina dhukkubaa yeroo ti, Yi+1 = cimina dhukkubaa yeroo itti aanutti ti+1, ti = yeroo safartuu jalqabaa (guyyoota keessatti), ti+1 = yeroo safartuu itti aanu (guyyoota keessatti), n = baay’ina waliigalaa qabxiiwwan yeroo ykn qabxiiwwan ilaalchaa. Olka’iinsa biqiltuu (cm), baay’ina damee biqiltuu tokkoo, fi baay’ina baala biqiltuu tokkoof dabalatee paaraameetotni guddina biqiltoota baaqelaa torbanitti guyyoota 21f baayoloojii baayoloojii hunda keessatti galmaa’aniiru.
Tokkoon tokkoon baayoloojii baayoloojii keessatti saamuda baala (baalli lammaffaa fi sadaffaa gubbaa irraa guutummaatti guddate) wal’aansa booda guyyaa 45 (wal’aansa dhumaa booda guyyoota 15) walitti qabamaniiru. Tokkoon tokkoon baayoloojii baayoloojii qodaa shan (qodaa tokkotti biqiltoota lama) of keessaa qaba ture. Tishuu caccabee gara 500 mg ta’u dukkana keessatti 4 °C irratti aseetoonii %80 fayyadamuun pigmentii footosinteetikii (kiloorofiilii a, kiloorofiilii b fi karootinooyidii) baasuuf itti fayyadameera. 24 h booda, saamuda seentirifuugii ta’ee fi supparnaataantiin qabiyyee kiloorofiilii a, kiloorofiilii b fi karootinooyidii murteessuuf akkaataa mala (Lichtenthaler, 1987) tiin xuuxuu dheerina dalgee adda addaa sadii irratti safaruun ispeektiroofootoomeetira UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan) fayyadamuun kolooriimeetiriidhaan walitti qabame (A470, A646 fi A663 nm) jedhamuun beekama. Dhumarratti qabiyyeen pigmentii footosinteetikii foormulaawwan armaan gadii 4–6 Lichtenthaler (1987) ibse fayyadamuun shallagameera.
Wal’aansa booda sa’aatii 72 (hpt) irratti, baalli (baalli lammaffaa fi sadaffaa guutummaatti guddate gubbaa irraa) tokkoon tokkoon baayoloojii irraa walitti qabame in situ histochemical localization of hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide anion (O2•−) tiif. Tokkoon tokkoon baayoloojii baayoloojii qodaa shan (qodaa tokkotti biqiltoota lama) of keessaa qaba ture. Tokkoon tokkoon fakkeessuu baayoloojii dachaa lama (fakkeessuu teeknikaa lama) xiinxalamee sirrii ta’uu, amanamummaa fi deebi’ee kan hojjetamuu danda’u mala kanaa mirkaneessuuf ture. H2O2 fi O2•− mala Romero-Puertas et al. (2004) fi Adam fi kkf. (1989) fooyya’iinsa xixiqqoo waliin. Histochemical localization H2O2 in situ, leaflets 0.1% DAB 10 mM Tris buffer (pH 7.8) keessatti vaakiyuumii infiltrated fi sana booda ho'a kutaa keessatti ifa keessatti daqiiqaa 60 inkuubeer. Barruulee 0.15% (v/v) TCA 4:1 (v/v) ethanol:chloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) keessatti bilicheeffamanii hanga dukkanaa’anitti ifaaf saaxilamaniiru. Haaluma walfakkaatuun, valvewwan 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.8) 0.1 w/v % HBT of keessaa qabuun histochemical localization O2•− in situ tiif vaakiyuumii keessa seenaniiru. Barruuleen ifa keessatti ho’a kutaa keessatti daqiiqaa 20f inkuubeer ta’aniiru, sana booda akka armaan olitti bilicheefamaniiru, achiis hanga tuqaaleen halluu diimaa/vaayoleetii dukkanaa’aan mul’atutti ibsaman. Ciminni halluu bunni (akka agarsiiftuu H2O2) ykn halluu diimaa-vaayoleetii (akka agarsiisaa O2•−) argame kan madaalame, paakeejii adeemsa fakkii ImageJ (http://fiji.sc; kan argame 7 Amajjii 2024) kan Fiijii fayyadamuun.
Malondialdehyde (MDA; akka mallattoo lipid peroxidation) akkaataa mala Du fi Bramlage (1992) fooyya’iinsa xiqqoo waliin murtaa’eera. Tokkoon tokkoon baayoloojii baayoloojii irraa baaloonni (baala guutummaatti guddatan lammaffaa fi sadaffaa gubbaa irraa) wal’aansa booda sa’aatii 72 (hpt) walitti qabamaniiru. Tokkoon tokkoon fakkeessaa baayoloojii qodaa shan (qodaa tokkotti biqiltoota lama) of keessatti qabata. Tokkoon tokkoon fakkeessuu baayoloojii dachaa lama (fakkeessuu teeknikaa lama) xiinxalamee sirrii ta’uu, amanamummaa fi deebi’ee kan hojjetamuu danda’u mala kanaa mirkaneessuuf ture. Gabaabumatti, tishuun baala lafa bu’e 0.5 g asiidii tiraakloorooaseetikii %20 (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) %0.01 butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) of keessaa qabuun MDA baasuuf fayyadameera. Sana booda qabiyyeen MDA supparnaataantii keessatti argamu UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) fayyadamuun xuuxuu 532 fi 600 nm irratti safaruun koloorimeetiriidhaan murtaa’ee booda akka nmol g−1 FWtti ibsame.
Madaallii antioksidaantota inzaayimii hin taanee fi inzaayimii ta’aniif, baalli (baalli lammaffaa fi sadaffaa guutummaatti guddate gubbaa irraa) tokkoon tokkoon fakkaattota baayoloojii irraa sa’aatii 72 booda wal’aansa booda (hpt) walitti qabameera. Tokkoon tokkoon baayoloojii baayoloojii qodaa shan (qodaa tokkotti biqiltoota lama) of keessaa qaba ture. Tokkoon tokkoon saamuda baayoloojii dachaa lama (saamuda teeknikaa lama) xiinxalameera. Baaloonni lama naayitiroojiinii dhangala’aatiin caccabsamanii kallattiin antioksidaantota inzaayimii fi inzaayimii hin taane, amiinoo asiidota waliigalaa, qabiyyee pirooliinii, ibsa jiinii fi baay’ina oksaaleetii murteessuuf itti fayyadamaniiru.
Waliigalatti feenooliikoonni bulbulamoo ta’an Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) fayyadamuun fooyya’iinsa xiqqoo mala Kahkonen et al. (1999) jedhamuun beekama. Gabaabumatti, tilmaamaan 0.1 g tishuu baala homogenized 20 ml 80% meetaanooliin dukkana keessatti h 24f baafamee, supernatant erga seentiriifiigeeshiniin booda walitti qabame. 0.1 ml sample extract 0.5 ml Folin-Ciocalteu reagent (10%) waliin makamee, s 30f raafamee daqiiqaa 5f dukkana keessatti hafe. Sana booda tokkoon tokkoon tuubii irratti furmaata soodiyeem kaarbooneetii %20 (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) 0.5 ml itti dabalamee, sirriitti makamee ho’a kutaa keessatti dukkana keessatti h 1f inkuubeer ta’e. Erga inkuubeshinii booda, xuuxamuun makaa walnyaatinsaa 765 nm irratti UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) fayyadamuun safarameera. Xiyyeeffannaan waliigala feenoolota bulbulamoo kanneen saamuda baafaman keessatti argaman kaarvii safartuu asiidii gaalikii (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) fayyadamuun kan murtaa’ee fi ulfaatina haaraa giraama tokkoof miligiraama asiidii gaaliik walqixa ta’een (ulfaatina haaraa mg GAE g-1) ibsameera.
Qabiyyeen waliigalaa flavonoid bulbulamaa akkaataa mala Djeridane et al. (2006) fooyya’iinsa xiqqoo waliin. Gabaabumatti, 0.3 ml meetaanooliin armaan olitti ibsame furmaata aluminiyeemii kilooraayidii %5 (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) 0.3 ml waliin makamee, ciminaan sochoofamee booda ho’a kutaa keessatti daqiiqaa 5f inkuubeer ta’ee, itti aansuudhaan furmaata pootaasiyeem aseeteetii %10 (Al-Gomhoria) 0.3 ml itti dabalame Qorichaa fi Meeshaalee Yaalaa, Kaayiroo, Masrii), sirriitti makamee ho’a kutaa keessatti daqiiqaa 30f dukkana keessatti inkuubeer ta’e. Erga inkuubeshinii booda, xuuxamuun makaa walnyaatinsaa 430 nm irratti UV-160A spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) fayyadamuun safarameera. Xiyyeeffannaan waliigalaa flavonoids bulbulamoo sample extracts keessatti rutin calibration curve (TCI America, Portland, OR, USA) fayyadamuun murtaa’ee booda akka miligiraama rutin walqixa giraama ulfaatina haaraa tokkoof (mg RE g-1 fresh weight) ibsame.
Qabiyyeen amiinoo asiidii bilisaa waliigalaa baala baaqelaa mala Yokoyama fi Hiramatsu (2003) yaada dhiyeessan irratti hundaa’uun ri’ajantii ninhayidiriinii fooyya’e (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) fayyadamuun kan murtaa’ee fi Sun et al. (2006) tiin kan qophaa’e. Gabaabumatti, tishuu lafa bu’e 0.1 g baafaara pH 5.4n kan baafame yoo ta’u, supparnaataantiin 200 μL ninhayidiriinii 200 μL (%2) fi piriidiinii 200 μL (%10; Ispeektarmii Keemikaalaa, New Brunswick, NJ, USA) waliin walnyaachuun, bishaan bullaa’aa keessatti daqiiqaa 30f inkuubeer ta’ee, qabbanaa’ee safarame 580 nm ispeektiroofootoomeetira UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan) fayyadamuun. Gama biraatiin pirooliin mala Bates tiin murtaa’eera (Bates et al., 1973). Pirooliin asiidii salfosalicylic %3 (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) tiin kan baafame yoo ta’u, erga seentiriifiigeeshiniin booda, supparnaataantiin 0.5 ml asiidii aseetikii glacial 1 ml (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) fi niinhydrin reagent waliin makamee, 90°C irratti daqiiqaa 45f inkuubeer ta’ee, qabbanaa’ee fi safarame 520 nm ispeektiroofootoomeetira armaan olitti fayyadamuun. Waliigala amiinoo asiidonni bilisaa fi pirooliinii baala baafame keessatti kaarvoota safartuu gilaayisiinii fi pirooliinii (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) fayyadamuun murtaa’eera, akkasumas akka mg/g ulfaatina haaraatti ibsameera.
Sochii inzaayimii inzaayimoota antioksidaantii murteessuuf, tilmaamaan 500 mg tishuu homogenized 50 mM Tris buffer (pH 7.8) 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) fi 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 100) of keessaa qabuun baafameera. USA), 10,000 × g irratti daqiiqaa 20f qabbanaa’aa (4 °C) jalatti seentirifuugii, fi supparnaataantiin (crude enzyme extract) walitti qabame (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Sana booda kaataalaasiin (CAT) 2 ml soodiyeem fosfeetii baafaara 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) fi 100 μl furmaata 269 mM H2O2 waliin walnyaachuun akkaataa mala Aebi (1984) tiin sochii inzaayimii isaa murteessee fooyya’iinsa xiqqoo (El-Nagar et al., 2023; Osmaan fi kkf, 2023). Sochiin inzaayimii Guaiacol-dependent peroxidase (POX) mala Harrach fi kkf fayyadamuun murtaa’eera. (2009) tiin kan qophaa’e. (2008) fooyya’iinsa xixiqqoo (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) fi sochiin inzaayimii poliifeenoolii oksaayideesii (PPO) erga walnyaatinsa 2.2 ml soodiyeem fosfeetii baafaara 100 mM (pH 6.0), 100 μl guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, 2023) waliin murtaa’eera. USA) fi 100 μl 12 mM H2O2. Malli kun (El-Nagar fi kkf, 2023; Osman fi kkf, 2023) irraa xiqqoo fooyya’eera. Qorannoon kun kan raawwatame erga furmaata kateekoolii 3 ml (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) haaraa 0.1 M fosfeetii baafaara (pH 6.0) keessatti qophaa’een erga walnyaatinsa booda raawwatameera. Sochiin CAT kan safarame diigamuu H2O2 240 nm (A240) irratti hordofuudhaan, sochiin POX 436 nm (A436) irratti dabaluu xuuxuu hordofuudhaan, fi sochiin PPO jijjiirama xuuxuu 495 nm (A495) irratti s 30 hunda daqiiqaa 3f UV-160A fayyadamuun galmeessuun safarameera ispeektiroofootoomeetira (Shimadzu, Jaappaan) jedhamuun beekama.
Yeroo dhugaa RT-PCR sadarkaa tiraanskriiptii jiiniiwwan antioksidaantii waliin walqabatan sadii, kanneen akka peroksisoomal katalaasii (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), supperoksaayidii dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), fi glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No.. KY195009.1), baala baaqelaa keessatti (baala lammaffaa fi sadaffaan guutummaatti guddate gubbaa irraa) 72 h erga wal’aansa dhumaa booda. Gabaabumatti, RNAn akkaataa pirootokoolii oomishtootaatiin Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) fayyadamuun adda baafameera. Sana booda, cDNA akkaataa qajeelfama oomishtootaatiin TOP scriptTM cDNA Synthesis Kit fayyadamuun walnyaatame. Tartiiba priimerii jiiniiwwan sadan armaan olii Gabatee Dabalataa S3 keessatti tarreeffamaniiru. PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) akka jiinii mana kunuunsaatti kan fayyadame yoo ta’u, ibsi jiinii fira mala 2-ΔΔCT fayyadamuun shallagameera (Livak and Schmittgen, 2001). Tasgabbiin aktiinii dhiibbaa baayootikii jalatti (wal-nyaatinsi wal hin simne legumes waliigalaa fi fangasii anthracnose Colletotrichum lindemuthiaanum gidduutti) fi dhiibbaa abiyootikii (gogiinsa, soogidda, ho’a gadi aanaa) agarsiifameera (Borges et al., 2012).
Jalqaba irratti meeshaa pirootiinii-pirootiinii BLAST (BLASTp 2.15.0+) fayyadamuun xiinxala siliikoo keessatti pirootiinota oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) S. sclerotiorum keessatti jiinoomii bal'aa raawwanne (Altschul et al., 1997, 2005). Gabaabumatti, OAH Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksaayidii: 1191702; lakkoofsa geejjibaa GenBank XP_040799428.1; amiinoo asiidota 342) fi Penicillium lagena (PlOAH; taaksiidii: 94218; lakkoofsa galmee GenBank irraa fayyadamne XP_056833920.1; BLASTp kan raawwatame daataa jiinooma S. sclerotiorum dhiheenya kana GenBank keessatti argamu irratti marsariitii Giddugala Odeeffannoo Baayooteknooloojii Biyyaalessaa (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ irratti.
Dabalataanis, jiiniin OAH tilmaamame S. sclerotiorum (SsOAH) irraa fi xiinxala jijjiirama jireenyaa fi muka faayiloojenetikii AfOAH A. fijiensis CBS 313.89 irraa fi PlOAH P. lagena irraa mala carraa guddaa MEGA11 (Tamura et al., 2021) fi moodeela JTT matrix-based model (Jones et al., 1992) irratti kan ibsame. Mukti faayiloojenetikii xiinxala walsimsiisaa dachaa tartiiba pirootiinii jiiniiwwan OAH tilmaamaman hunda (SsOAH) S. sclerotiorum irraa fi tartiiba gaaffii Meeshaa Hiriirsa Danqaraa irratti hundaa’e (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) fayyadamuun walitti makame (Papadopoulos fi Agarwala, 2007). Dabalataanis, tartiiba amiinoo asiidii SsOAH S. sclerotiorum irraa argame kan walsimsiisu gaarii ta’e tartiiba gaaffii (AfOAH fi PlOAH) (Larkin et al., 2007) waliin ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) fayyadamuun kan walsimsiifame yoo ta’u, naannoowwan qindaa’ina keessatti eegamanii meeshaa ESPript (version 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php irratti kan argamudha.
Kana malees, domeenii bakka bu’oota dalagaa tilmaamaman fi iddoowwan eegamanii S. sclerotiorum SsOAH meeshaa InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) fayyadamuun maatii adda addaatti wal-qunnamtiidhaan ramadamaniiru (Blum et al., 2021). Dhumarratti, moodeela caasaa diimeshinii sadii (3D) S. sclerotiorum SsOAH tilmaamame Motora Beekamtii Pirootiinii Homology/Analogy (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) fayyadamuun raawwatamee fayyadamuun mirkanaa’eera sarvarii SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) kan jedhu (Biasini fi kkf, 2014). Caasaaleen diimeshinii sadii tilmaamaman (bifa PDB) paakeejii UCSF-Chimera (version 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) fayyadamuun wal-qunnamtiidhaan mul’ataniiru (Pettersen et al., 2004).
Sadarkaa tiraanskriipshinii oksaaloaseeteetii aseetiilhayidirooleesii (SsOAH; lakkoofsa geejjibaa GenBank: XM_001590428.1) maayseeliiyaa Iskileerootiniiyaa iskileerotiyoorum keessatti murteessuuf PCR yeroo dhugaa baay’inaan fayyadameera. Gabaabumatti, S. sclerotiorum gara flask PDB of keessaa qabu keessatti talaalamee guddina mycelial kakaasuuf 25 ± 2 °C irratti 24 h 150 rpm fi dukkana dhaabbataa (24 h) keessatti incubator raafamuu (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) keessatti kaa’ame. Sana booda, seelonni L-ornithine fi fangasiidii Rizolex-T tiin qindoomina IC50 isa dhumaa (tilmaamaan 40 fi 3.2 mg/L, akkaataa wal duraa duubaan) irratti wal’aanamanii booda haala walfakkaatuun h 24 kan biraaf aadaa godhaman. Erga inkuubeer ta’ee booda aadaan daqiiqaa 5f 2500 rpm irratti seentirifuugii taasifamee fi supparnaataantiin (fangal mycelium) xiinxala ibsa jiiniitiif walitti qabame. Haaluma walfakkaatuun, biqiltoota dhukkuba kanaan qabaman kanneen fuula tishuuwwan dhukkuba kanaan qabaman irratti boca adii fi maayseeliyeemii suufii uumuun erga infekshinii booda sa’aatii 0, 24, 48, 72, 96, fi 120 irratti walitti qabameera. RNAn maayiseeliyeemii fangasii irraa kan baafame yoo ta’u, sana booda cDNA akka armaan olitti ibsametti walnyaatame. Tartiiba priimerii SsOAH Gabatee Dabalataa S3 keessatti tarreeffamaniiru. SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) akka jiinii mana kunuunsaatti kan fayyadame yoo ta’u, ibsi jiinii fira mala 2-ΔΔCT fayyadamuun shallagameera (Livak and Schmittgen, 2001).
Asiidiin oksaalikii akkaataa mala Xu fi Zhang (2000) tiin fooyya’iinsa xiqqoo taasifameen saamuda biqiltootaa paatojeenii fangasii Sclerotinia sclerotiorum of keessaa qaban boqqolloo deekstroosii broth (PDB) fi biqiltoota keessatti murtaa’eera. Gabaabumatti, S. sclerotiorum isolates gara flasks PDB of keessaa qabu keessatti talaalamanii booda guddina mycelial kakaasuuf 150 rpm 25 ± 2 °C irratti 150 rpm irratti dukkana dhaabbataa (24 h) keessatti guyyoota 3-5f inkubaator raafama (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) keessatti aadaa godhame. Erga inkuubeshinii booda aadaan fangasii jalqaba waraqaa calaqqee Whatman #1 keessaa calalamee booda 2500 rpm irratti daqiiqaa 5f seentirifuugii taasifamee haftee maayseeliyeemii balleesse. Suppernataantiin walitti qabamee 4°C irratti kuufamee murtee baay’ina oksaaleetii dabalataaf. Qophii saamuda biqiltootaaf, tilmaamaan 0.1 g ciccitaa tishuu biqiltootaa bishaan distiiliitiin (yeroo hunda 2 ml) yeroo sadii baafameera. Sana booda saamuda 2500 rpm daqiiqaa 5f seentirifuugii taasifamee, supparnaataantiin waraqaa filtara Whatman No. 1 keessaa goggogaa calalamee xiinxala dabalataaf walitti qabame.
Xiinxala baay’ina asiidii oksaalikiitiif, makaan walnyaatinsaa tartiiba armaan gadiitiin tuubii geejjibaa cufame keessatti qophaa’e: saamuda 0.2 ml (ykn PDB culture filtrate ykn furmaata istaandaardii asiidii oksaalikii), 0.11 ml biroomophenol blue (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0.198 ml asiidii salfiyuurii 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) fi 0.176 ml 100 mM potassium dichromate (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), sana booda furmaanni bishaan distilled tiin gara 4.8 ml tti diluted, ciminaan makamee battalumatti bishaan 60 °C keessa kaa’ame dhaqna dhiqachuu. Daqiiqaa 10 booda, walnyaatinsi sun furmaata soodiyeem haayidirooksaayidii (NaOH; 0.75 M) 0.5 ml itti dabaluun dhaabbate. Xuuxuun (A600) makaa walnyaatinsaa UV-160 spectrophotometer (Shimadzu Corporation, Japan) fayyadamuun 600 nm irratti safarameera. PDB fi bishaan distilled akka to’annootti baay’ina calaqqisiisa aadaa fi saamuda biqiltootaa akkaataa wal duraa duubaan itti fayyadamaniiru. Xiyyeeffannaan asiidii oksaalikii calaqqitoota aadaa keessatti, kan akka maaykiroogiraamii asiidii oksaalikii mililiitira PDB meediyaa tokkotti (μg.mL−1) ibsame, fi baala baala keessaa, akka maaykiroogiraamii asiidii oksaalikii ulfaatina haaraa giraama tokkoof (μg.g−1 FW) ibsame, kaarvii safartuu asiidii oksaalikii fayyadamuun murtaa’eera (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Guutummaa qorannichaa keessatti yaalii hunduu dizaayinii guutummaatti tasaa (CRD) ta’een kan qophaa’e yoo ta’u, wal’aansa tokkoof baayoloojii ja’a fi baayoloojii tokkoof qodaa shan (qodaa tokkotti biqiltoota lama) yoo haala biraatiin ibsame malee. Fakkeenyonni baayoloojii dachaa lama (fakkeessuu teeknikaa lama) xiinxalamaniiru. Fakkeenyonni teeknikaa yaalii walfakkaataa irra deebi’uu danda’uu isaa sakatta’uuf kan itti fayyadaman yoo ta’u, irra deebi’uu sobaa akka hin uumamneef xiinxala istaatiksii keessatti hin fayyadamne. Odeeffannoon istaatiksii xiinxala jijjiirama (ANOVA) fayyadamuun itti aansuudhaan qorannoo garaagarummaa amanamummaa guddaa (HSD) Tukey-Kramer (p ≤ 0.05) fayyadamuun xiinxalameera. Yaalii in vitro tiif gatiiwwan IC50 fi IC99 moodeela probit fayyadamuun kan shallagame yoo ta’u, gidduugaleessi amantaa %95 shallagameera.
Walumaagalatti adda baafaman afur maasii xaafii adda addaa Bulchiinsa El Ghabiyaa, Masrii irraa walitti qabameera. Giddugaleessa PDA irratti, adda baafamtoonni hundinuu maayseeliyeemii adii kiriimii ta’ee fi dafee adii suufii ta’e (Fakkii 1A) fi sana booda sadarkaa iskileerootiyeemii irratti beejii ykn bunaa ta’e oomishaniiru. Iskileerootiyaan yeroo baay’ee dhangala’aa, gurraacha, boca geengoo yookiin sirrii hin taane, dheerinni isaanii mm 5.2 hanga 7.7 fi daayameetira mm 3.4 hanga 5.3 kan qabani dha (Fakkii 1B). Isolate afur guyyoota 10-12 25 ± 2 °C irratti inkuubeshinii booda qarqara meediyaa aadaa irratti akkaataa marginal isclerotia guddisan illee (Fak. 1A), lakkoofsi sclerotia gabatee tokkoo isaan gidduutti garaagarummaa guddaa qaba (P < 0.001), isolate 3 lakkoofsa sclerotia olaanaa qaba (32.33 ± 1.53 sclerotia per gabatee Fak.1C). Haaluma walfakkaatuun, adda baafame #3 adda baafamtoota biroo caalaa PDB keessatti asiidii oksaalikii baay’ee uumeera (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Fak. 1D). Isolate #3 amala morfoloojii fi maaykirooskoopii addaa fangasii faayitoopatojeenikii Sclerotinia sclerotiorum agarsiise. Fakkeenyaaf, PDA irratti, koloniin adda baafame #3 saffisaan guddate, adii kiriimii (Fakkii 1A), beejii duubatti deebi’aa ykn keelloo-buraa’aa saalmoonii salphaa, fi guutummaatti fuula gabatee daayameetira seentimeetira 9 qabu uwwisuuf 25 ± 2°C irratti guyyoota 6-7 barbaachisa. Amaloota morfoloojii fi maaykirooskoopii armaan olitti ibsaman irratti hundaa’uun adda baafame #3 Sclerotinia sclerotiorum jedhamee adda baafameera.
Fakkii 1. Amaloota fi dhukkuba S. sclerotiorum midhaan legume waliigalaa irraa adda baafame. (A) Guddina maayseeliiyaa S. sclerotiorum adda baafaman afur meediyaa PDA irratti, (B) sclerotia adda baafaman S. sclerotiorum afur, (C) baay’ina sclerotia (gabatee tokkotti), (D) dhangalaa’uu asiidii oxalic meediyaa PDB irratti (μg.mL−1), fi (E) cimina dhukkubaa (%) S. sclerotiorum adda baafaman afur legume daldalaaf saaxilamoo ta’an irratti gosa Giiza 3 haala mana magariisaa jalatti. Gatiin giddugaleessa ± SD fakkaattota baayoloojii shan (n = 5) bakka bu’u. Qubeewwan adda addaa garaagarummaa istaatiksii wal’aansoowwan gidduu jiru agarsiisu (p < 0.05). (F–H) Mallattoon boca adii idilee hidda lafa olii fi siliikii irratti mul’ateera, akkaataa wal duraa duubaan, guyyoota 10 booda talaallii adda baafame #3 (dpi) booda. (I) Xiinxalli jijjiirama naannoo ispeesara keessoo tiraanskriiptii (ITS) adda baafame S. sclerotiorum #3 mala carraa guddaa fayyadamuun kan raawwatame yoo ta’u, adda baafamtoota/gosoota wabii 20 kuusa deetaa Giddugala Odeeffannoo Baayooteknooloojii Biyyaalessaa (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) irraa argaman waliin walbira qabamee ilaalameera. Lakkoofsi sararoota tuutaa olitti argaman uwwisa naannoo (%) kan agarsiisan yoo ta’u, lakkoofsi sararoota tuutaa gadii ammoo dheerina damee agarsiisu.
Kana malees, dhukkuba uumuu mirkaneessuuf, adda baafaman S. sclerotiorum afur argaman haala mana magariisaa jalatti gosa baaqelaa daldalaaf saaxilamoo Giza 3 talaaluuf kan itti fayyadaman yoo ta’u, kunis yaada Koch’s postulates wajjin kan walsimudha (Fak. 1E). Fangaasii adda baafaman hundinuu dhukkuba kan uumuu fi baaqelaa magariisaa (cv. Giza 3) faaluu kan danda’an ta’us, kutaalee lafa olii hunda irratti (Fak. 1F), keessumaa hidda (Fak. 1G) fi poodii (Fak. 1H) irratti, talaallii booda guyyoota 10 (dpi) irratti mallattoo boca adii idilee fiduudhaan, adda baafame 3 yaalii of danda’e lama keessatti adda baafame kan baay’ee aggaammii qabu ture. Isolate 3 biqiltoota baaqelaa irratti cimina dhukkubaa olaanaa (%) qaba (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, fi 76.7 ± 3.1 guyyoota 7, 14, fi 21 booda, akkaataa wal duraa duubaan; Fakkii 1F).
Adda baasuun S. sclerotiorum isolate #3 isa baay’ee weerartuu ta’e tartiiba internal transcribed spacer (ITS) irratti hundaa’uun daran mirkanaa’eera (Fak. 1I). Xiinxalli faayiloojenetikii adda baafame #3 fi adda baafame/gosoota wabii 20 gidduutti walfakkeenya olaanaa (>99%) isaan gidduutti agarsiiseera. S. sclerotiorum isolate #3 (533 bp) kan Ameerikaa S. sclerotiorum isolate LPM36 sanyii baaqelaa goggogaa (GenBank accession number MK896659.1; 540 bp) fi Chaayinaa S. sclerotiorum isolate YKY211 (GenBank accession number) irraa adda baafame waliin walfakkeenya olaanaa qabaachuun isaa hubatamuu qaba OR206374.1; Tartiiba haaraan kun kuusaawwan deetaa NCBI keessatti kuufamee “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank accession number PV202792) jedhamee moggaafameera. Isolate 3 isolate baay’ee weerartuu ta’uun isaa hubachuun ni danda’ama; kanaaf, adda baafame kun yaalii itti aanu hunda keessatti qorannoof filatame.
Sochiin farra baakteeriyaa diyaamiinii L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) qindoomina adda addaa (12.5, 25, 50, 75, 100 fi 125 mg/L) S. sclerotiorum isolate 3 irratti in vitro qoratameera. L-ornithine bu’aa farra baakteeriyaa kan agarsiisu yoo ta’u, suuta suutaan guddina raadiyaalii S. sclerotiorum hyphae haala doosiin hirkateen dhorkuu isaati (Fakkii 2A, B). Xiyyeeffannoo olaanaa qoratame (125 mg/L) irratti, L-ornithine saffisa guddina maayseelii dhorkuu olaanaa agarsiise (99.62 ± 0.27%; Fakkii 2B), kunis faangisiidii daldalaa Rizolex-T (saffisa dhorkaa 99.45 ± 0.39%; Fakkii 2C) qindoomina olaanaa qoratame (10 mg/L) waliin walqixa ta’e, kunis walfakkaataa agarsiisa bu’a qabeessummaa isaa.
Fakkii 2. Sochii farra baakteeriyaa in vitro L-ornithine Sclerotinia sclerotiorum irratti. (A) Walmadaalchisuu sochii farra baakteeriyaa qindoomina adda addaa L-ornithine S. sclerotiorum irratti fangasii daldalaa Rizolex-T (10 mg/L) waliin. (B, C) Saffisa dhorkuu (%) guddina maayseelii S. sclerotiorum erga qindoomina adda addaa L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 fi 125 mg/L) ykn Rizolex-T (2, 4, 6, 8 fi 10 mg/L) tiin wal’aanamaa booda, akkaataa wal duraa duubaan. Gatiin giddugaleessa ± SD fakkaattota baayoloojii shan (n = 5) bakka bu’u. Qubeewwan adda addaa garaagarummaa istaatiksii wal’aansoowwan gidduu jiru agarsiisu (p < 0.05). (D, E) Xiinxala rigreesshinii moodeela Probit L-ornithine fi fangasii daldalaa Rizolex-T, akkaataa wal duraa duubaan. Sararri gara boodaatti deebi’uu moodeela piroobitii akka sarara jabaa buluutti kan agarsiifamu yoo ta’u, gidduugaleessi amantaa (%95) akka sarara diimaa ciccitaa ta’etti agarsiifama.
Kana malees, xiinxalli rigreesshinii piroobitii kan raawwatame yoo ta’u, pilaatonni walgitan gabatee 1 fi fakkii 2D,E irratti agarsiifamaniiru. Gabaabumatti, gatii qaxxaamuraa fudhatama qabu (y = 2.92x − 4.67) fi istaatiksii guddaa walqabate (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 fi p < 0.0001; Fakkii 2D) L-ornithine sochii farra fangasii S. sclerotiorum irratti guddachuu agarsiise Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Kooksii fi Isneel R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 fi p < 0.0001) (Gabatee 1).
Gabatee 1. Gatii walakkaa ol’aanaa qindoomina inhibiishinii (IC50) fi IC99 (mg/l) L-ornithine fi fangasii daldalaa “Rizolex-T” S. sclerotiorum irratti.
Walumaagalatti, L-ornithine (250 mg/L) biqiltoota baaqelaa waliigalaa wal’aanamanii irratti biqiltoota S. sclerotiorum-in faalaman hin wal’aanamneen wal bira qabamee yoo ilaalamu guddinaa fi cimina boca adii haalaan hir’isee jira (to’annoo; Fakkii 3A). Gabaabumatti, ciminni dhukkubaa biqiltoota to’annoo dhukkuba kanaan qabaman kan hin yaalamne suuta suutaan dabaluu (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, fi 92.33 ± 3.06%) ta’us, L-ornithine hamma dhukkubichaa (%) yaalii guutuu keessatti haalaan hir’ise (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, fi 26.36 ± 3.07) guyyoota 7, 14, fi 21 wal’aansa booda (dpt), akkaataa wal duraa duubaan (Fakkii 3A). Haaluma walfakkaatuun biqiltoonni baaqelaa S. sclerotiorumn faalaman L-ornithine 250 mg/L yeroo yaalaman, bal’inni kaarvii guddina dhukkubaa (AUDPC) jala jiru to’annoo hin yaalamne keessatti 1274.33 ± 33.13 irraa gara 281.03 ± 7.95tti gadi bu’eera, kunis kan to’annoo pozaatiivii 50 mg/L irraa xiqqoo gadi bu’eera Fangasiidii Rizolex-T (183.61 ± 7.71; Fak. 3B). Yaalii lammaffaa irrattis adeemsi walfakkaataan mul’ateera.
Fak 3. Dhiibbaa fayyadama alaa L-ornithine haala mana magariisaa jalatti guddina marga adii baaqelaa waliigalaa Sclerotinia sclerotiorum tiin dhufu irratti qabu. (A) Kaarvii guddina dhukkubaa boca adii baaqelaa waliigalaa erga 250 mg/L L-ornithine tiin wal’aanamanii booda. (B) Naannoo kaarvii guddina dhukkubaa (AUDPC) jala boca adii baaqelaa waliigalaa erga L-ornithine tiin wal’aanamanii booda. Gatiin giddugaleessa ± SD fakkaattota baayoloojii shan (n = 5) bakka bu’u. Qubeewwan adda addaa garaagarummaa istaatiksii wal’aansoowwan gidduu jiru agarsiisu (p < 0.05).
L-ornithine 250 mg/L alaatti fayyadamuun guyyoota 42 booda olka’iinsa biqiltuu (Fak. 4A), baay’ina damee biqiltuu tokkoof (Fak. 4B), fi baay’ina baala biqiltuu tokkoof (Fak. 4C) suuta suutaan dabaleera. Faanjiisaayidiin daldalaa Rizolex-T (50 mg/L) paaraameetota soorataa qorataman hunda irratti dhiibbaa guddaa kan qabu yoo ta’u, fayyadamni exogenous 250 mg/L L-ornithine to’attoota hin wal’aanamneen wal bira qabamee yoo ilaalamu bu’aa guddaa lammaffaa qaba (Fak. 4A–C). Gama biraatiin, wal’aansi L-ornithine qabiyyee pigmentii footosinteetikii kiloorofiilii a (Fak. 4D) fi kiloorofiilii b (Fak. 4E) irratti dhiibbaa guddaa hin qabu, garuu qabiyyee waliigalaa karootinooyidii (0.56 ± 0.03 mg/g fr wt) to’annoo negaatiivii (0.44 ± 0.02 mg/g fr wt) fi to’annoo pozaatiivii (0.46 ± 0.02 mg/g fr wt; Fak. 4F). Walumaagalatti, bu’aawwan kunniin L-ornithine legumes wal’aanamaniif phytotoxic akka hin taanee fi guddina isaanii illee kakaasuu akka danda’u agarsiisu.
Fak 4. Dhiibbaa fayyadamni L-ornithine alaa amala guddinaa fi pigmentii footosinteetikii baala baaqelaa haala mana magariisaa jalatti Sclerotinia sclerotiorum tiin faalame irratti qabu. (A) Olka’iinsa biqiltuu (cm), (B) Baay’ina damee biqiltuu tokkoof, (C) Baay’ina baala biqiltuu tokkoof, (D) Qabiyyee kiloorofiilii a (mg g-1 fr wt), (E) Qabiyyee kiloorofiilii b (mg g-1 fr wt), (F) Qabiyyee karootinooyidii waliigalaa (mg g-1 fr wt). Gatiin giddugaleessa ± SD irra deddeebiin baayoloojii shan (n = 5) dha. Qubeewwan adda addaa garaagarummaa istaatiksii wal’aansoowwan gidduu jiru agarsiisu (p < 0.05).
In situ histochemical localization gosoota oksijiinii ri’aaktiivii (ROS; akka haayidiroojiinii peerooksaayidii [H2O2]tti ibsame) fi raadikaalota bilisaa (akka aniyaanota supperoksaayidii ibsaman [O2•−]) hojiirra oolmaan alaa L-ornithine (250 mg/L) kuufama H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW) haalaan akka hir’ise mul’ise; Fak.5A) fi O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; Fak. 5B) kuufama biqiltoota dhukkuba kanaan qabaman lamaanuu (173.31 ± 12.06 fi 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, akkaataa walduraa duubaan) fi biqiltoota 50 mg/L faangisaayidii daldalaatiin wal’aanamanii wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu Rizolex-T (170.12 ± 9.50 fi 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, akkaataa wal duraa duubaan) sa’aatii 72 irratti. Sadarkaan ol’aanaan H2O2 fi O2•− hpt jalatti kuufame (Fak. 5A, B). Haaluma walfakkaatuun, qorannoon TCA irratti hundaa’e malondialdehyde (MDA) biqiltoonni baaqelaa S. sclerotiorumn faalaman baala isaanii keessatti MDA sadarkaa olaanaa (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) akka kuufatan agarsiise (Fak. 5C). Haa ta’u malee, L-ornithine exogenous fayyadamuun lipid peroxidation baay’ee hir’ise akka ragaan qabiyyee MDA biqiltoota wal’aanamanii keessatti hir’achuu (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
Fak 5. Dhiibbaa fayyadamni L-ornithine alaa mallattoolee gurguddoo dhiibbaa oksijiinii fi mala ittisa antioksidaantii inzaayimii hin taane baala baaqelaa S. sclerotiorum tiin faalame irratti haala mana magariisaa jalatti sa’aatii 72 booda infekshinii booda. (A) Haayidroojiinii peerooksaayidii (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt, (B) supperoksaayidii aniyaanii (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt, (D) waliigala feenoolii bulbulamoo (mg GAE g−1 FW) 72 hpt, (E) waliigala flavonoids bulbulamoo (mg RE g−1 FW) 72 hpt, (F) waliigala amiinoo asiidota bilisaa (mg g−1 FW) 72 hpt, fi (G) qabiyyee pirooliinii (mg g−1 FW) 72 hpt. Gatiin giddugaleessa ± istaandaardii jijjiirama (giddugaleessa ± SD) baayoloojii baayoloojii 5 (n = 5) bakka bu’a. Qubeewwan adda addaa garaagarummaa istaatiksii wal’aansoowwan gidduu jiru agarsiisu (p < 0.05).