Yeroo ammaa *Teessoo ammaa: Kolon 50931, Jarmanii, Qorannoo Kilaastara Gahumsa Kolon Deebii Dhiphina Seelii Dhukkuboota Dulloomuu wajjin walqabatan (CECAD) irratti.
Niwuroodegenereeshiniin dhukkuboota maaytookondriyaa pilaastikii meetaabolii niwuroonotaa daangeffamee waan ta’eef akka waan hin deebineetti ilaalama, garuu dhiibbaan hojii dhabuun maaytookondriyaa ofiin of bulchuu seelii meetaabolii niwuroonii qaama keessatti qabu irratti qabu haala gaariin hin hubatamne. Asitti, nuyi pirootiyoomii seelii addaa niwuroonota Purkinje hanqina OXPHOS tarkaanfataa kan daayinamiksii fiyuushinii maaytookondriyaa jeeqameen uumame waliin seensifna. Nu maaytookondriyaa dysfunction jijjiirama gadi fagoo dirree proteomics kakaase, kunis dhuma irratti tartiiba activation sagantaalee meetaabolii sirrii du'a seelii dura akka taasise arganne. Akka hin eegamnetti, nuyi induction ifa ta'e pyruvate carboxylase (PCx) fi inzaayimoota farra dulloomuu biroo kanneen gidduugaleessota marsaa TCA dabalan murteessine. Inhibition of PCx dhiphina oksijiinii fi neurodegeneration hammeesse, kunis atherosclerosis niwuroonota OXPHOS hin qabne keessatti bu'aa eegumsaa akka qabu agarsiisa. Niwuroonota dhuma irratti manca’an keessatti fiyuushiniin maaytookondriyaa deebisuun amala meetaabolii kana guutummaatti duubatti deebisa, kanaanis du’a seelii ittisa. Argannoon keenya karaalee kanaan dura hin beekamne kanneen hojii dhabuu maaytookondriyaa dandamachuu kennan adda baasuun sadarkaa dhumaa dhukkubichaa keessattillee niwuroodegenereeshiniin duubatti deebi'uu akka danda'u agarsiisa.
Gaheen giddugaleessaa maaytookondriyaa meetaabolii anniisaa niwuroonii eeguu keessatti qabu mallattoolee niwurooloojikaalaa bal’aa dhukkuboota maaytookondriyaa namaa wajjin walqabataniin cimsa. Dhukkuboonni kun harki caalaan isaanii jijjiirama jiinii ibsa jiinii maaytookondriyaa to’atu (1, 2) ykn balleessuu jiinii daayinamiksii maaytookondriyaa wajjin walqabatee kan dhufu yoo ta’u, kunis al-kallattiin tasgabbii DNA maaytookondriyaa (mtDNA) irratti dhiibbaa qaba (3, 4). Hojiin moodeelota bineensotaa keessatti hojjetame akka agarsiisutti, deebii hojii dhabuu maaytookondriyaa tishuuwwan naannoo jiran keessatti, karaaleen meetaabolii konsarvaatiivii (5-7) hojiirra oolchuun akka danda’amu, kunis hubannoo gadi fageenyaa paatogenesis dhukkuboota walxaxaa kanaaf odeeffannoo barbaachisaa ta’e kenna. Faallaa kanaatiin, hubannoon keenya jijjiirama meetaabolii gosoota seelii addaa sababa waliigalaa kufaatii oomisha adeenoosiin tiraayifoosfeetii sammuu (ATP) sammuutiin dhufu bu’uuraa dha (8), galmoota wal’aansaa dhukkuba ittisuuf ykn ittisuuf itti fayyadamuu danda’an adda baasuun barbaachisaa ta’uu cimsee ibsa. Niwuroodegeneration ittisuu (9). Hanqinni odeeffannoo seelonni narvii gosoota seelii tishuuwwan naannoo isaanii jiran waliin wal bira qabamee yoo ilaalamu baay’ee daangeffamee kan ilaalamu ta’uu isaati (10). Seelonni kunniin dhiyeessii meetaabolayitoota niwuroonotaaf qindeessuun daddarbiinsa siinaaptikii guddisuu fi haala miidhamuu fi dhukkubaaf deebii kennuu keessatti gahee giddugaleessaa akka qaban yoo ilaalle, dandeettiin meetaabolii seelii haala qormaataa tishuu sammuu wajjin walsimsiisuu seelota glial qofa irratti daangeffama jechuun ni danda’ama (11-14). Kana malees, heterogeneity seelii uumamaan tishuuwwan sammuu qorannoo jijjiirama meetaabolii gareewwan xiqqaa niwuroonota adda ta'an keessatti uumamu baay'inaan gufachiisa. Kanarraa kan ka’e, bu’aa seelii fi meetaabolii sirrii hojii dhabuu maaytookondriyaa niwuroonota keessatti fidu ilaalchisee wanti beekamu xiqqaadha.
Bu'aa meetaabolii hojii dhabuu maaytookondriyaa hubachuuf, niwuroonota Purkinje (PNs) sadarkaa adda addaa niwuroodegeneration balleessuu fiyuushinii meembraanii alaa maaytookondriyaa (Mfn2) irraa kan ka'e adda baasne. Muutaashiniin Mfn2 nama keessatti bifa niwuroopatii miira sochii qaamaa dhalootaa Charcot-Marie-Tooth gosa 2A (15) jedhamuun beekamu waliin kan walqabatu ta'us, hantuuta keessatti haal-duree balleessuun Mfn2 mala hojii dhabuu oksideeshinii Foosfooraayileeshinii (OXPHOS) induction akka gaariitti beekamaadha. Gosoonni xiqqaan niwuroonotaa adda addaa (16-19) fi fenootayipiin niwuroodegenereetii bu’aa kanaa mallattoolee niwurooloojikaalaa guddachaa dhufan kan akka jeequmsa sochii (18, 19) ykn ataaksii sammuu (16) wajjin kan dhufanidha. Walnyaatinsa asxaa-bilisa baay'ina (LFQ) proteomics, meetabolomics, suuraa, fi mala vaayirasii fayyadamuun, nuti guddina neurodegeneration cimsee pyruvate carboxylase (PCx) fi sababoota biroo arteriosclerosis PNs in vivo keessatti hirmaatan akka kakaasu agarsiifna The expression of enzymes. Barbaachisummaa argannoo kanaa mirkaneessuuf, nuti addatti ibsa PCx Mfn2-hir'ina PNs keessatti gadi-regulated, fi opereshiniin kun dhiibbaa oksijiinii hammeessuu fi neurodegeneration saffisiise, kanaan azoospermia du'a seelii confers Metabolic adaptability mirkaneessuu arganne. Ibsi hamaan MFN2 guutummaatti hanqina OXPHOS hamaa, fayyadama guddaa DNA maaytookondriyaa, fi mul'ataan toora maaytookondriyaa cabe, bifa niwuroodegeneration kun sadarkaa olaanaa dhukkubaa keessatti illee du'a seelii dura fayyuu akka danda'u caalaatti cimsa.
Mfn2 knockout PNs keessatti maaytookondriyaa mul'isuuf, gosa hantuutaa kan Cre-hirkataa maaytookondriyaa pirootiinii keelloo fluorescent (YFP) (mtYFP) (20) Cre ibsa irratti xiyyeeffachuuf hayyamu fayyadamnee fi morfoloojii maaytookondriyaa in vivo sakatta'e. Jiinii Mfn2 PNs keessatti balleessuun isaa suuta suutaan qoqqoodinsa networkii maaytookondriyaa akka fidu arganne (Fakkii S1A), jijjiiramni jalqabaa umurii torban 3 irratti argame. Faallaa kanaatiin, manca’iinsi guddaan laayibara seelii PN, akka ragaa dhabuu Calbindin immunostaining, hanga umurii torban 12tti hin jalqabne (Fakkii 1, A fi B). Jijjiirama morfoloojii maaytookondriyaa jalqabaa fi jalqaba du’a niwuroonii mul’atu gidduutti yeroon wal hin simne jijjiirama meetaabolii du’a seelii dura hojii dhabuu maaytookondriyaatiin ka’u qorachuuf nu kakaase. Nu YFP (YFP +)-ibsu PN adda baasuuf tooftaa fluorescence-activated cell sorting (FACS) irratti hundaa'e hojjenne (Fakkii 1C), fi hantuuta to'annoo (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), kana booda CTRL (Fakkii S1B) jedhamee waamamu keessatti. Optimization tooftaa gating cimina fira YFP mallattoo irratti hundaa'e YFP + qaama (YFPhigh) PNs non-PNs (YFPneg) (Fakkii S1B) ykn tilmaama fluorescent axon / dendritic fragments (YFPlow; Fakkii S1D, bitaa), confocal microscope mirkanaa'e (Fakkii S1D, mirga) irraa qulqulleessuuf nu dandeessisa. Eenyummaa uummata ramadame mirkaneessuuf, nuti LFQ proteomics fi sana booda xiinxala qaama ijoo gaggeessine, fi seelii YFPhigh fi YFPneg gidduutti addaan bahuun ifa ta'e akka jiru arganne (Fakkii S1C). Seelonni YFPhigh badhaadhina qulqulluu mallattoolee PNs beekamoo agarsiisan (jechuunis Calb1, Pcp2, Grid2 fi Itpr3) (21, 22), garuu badhaadhina pirootiinota yeroo baay'ee niwuroonota ykn gosoota seelii biroo keessatti ibsaman hin jiru (Fakkii 1D) ). Walbira qabamee yoo ilaalamu saamuda seelii YFPhigh ramadaman keessatti yaalii of danda’e keessatti walitti qabame gidduutti taasifameen, koofiishinii walqabsiisaa> 0.9 agarsiise, kunis baayoloojii baayoloojii gidduutti walhormaata gaarii agarsiisa (Fakkii S1E). Walumaagalatti, daataaleen kun karoora keenya kan PN danda’amu adda baasuu cimaa fi adda ta’e mirkaneessaniiru. Sirni konkolaachisaa L7-cre fayyadame erga da'umsa booda torban jalqabaa keessatti moosaajii irra deebiin walitti makamuu waan kakaasuuf (23), hantuuta CTRL fi haala (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Niwuroonota walitti qabuu irraa ajjeesuu jalqabne. Erga irra deebiin walitti makamuu xumuramee booda umurii torban 4tti Mfn2cKO jedhama. Akka qabxii xumuraatti, nuyi torban 8 yeroo laayibariin PN hin tuqamne filanne, ciccituu maaytookondriyaa ifa ta'us (Fakkii 1B fi Fakkii S1A). Walumaagalatti, nuti waliigala pirootiinota 3013 quantified, isaan keessaa gara 22% MitoCarta 2.0 annotations irratti hundaa'uun mitochondrial proteome akka mitochondria (Fakkii 1E) (Fakkii 1E) (24). Xiinxalli ibsa jiini adda addaa torban 8ffaa irratti raawwatame pirootiinota hunda keessaa %10.5 qofti jijjiirama guddaa akka qaban agarsiise (Fakkii 1F fi Fakkii S1F), kana keessaa pirootinoonni 195 gadi bu’anii kan to’ataman yoo ta’u pirootinoonni 120 ammoo ol kan to’ataman (Fakkii 1F). “Xiinxalli karaa kalaqaa” tuuta daataa kanaa jiiniiwwan garaagarummaadhaan ibsaman irra caalaa tuuta daandii meetaabolii addaa daangeffame keessaa akka ta’an kan agarsiisu ta’uun isaa hubatamuu qaba (Fakkii 1G). Kan nama ajaa'ibu, downregulation karaalee OXPHOS fi mallattoo kaalsiyeemii wajjin walqabatan induction of mitochondrial dysfunction PNs fiyuushinii-hir'ina qaban mirkaneessus, gosootni biroo kanneen irra caalaa meetaabolii amiinoo asiidii hirmaachisu haalaan upregulated dha, kunis meetaabolii maaytookondriyaa keessatti uumamu waliin wal simu Rewiring is consistent. hojii dhabuu.
(A) Suuraalee konfookaalii bakka bu’oota kutaalee sammuu hantuuta CTRL fi Mfn2cKO kanneen PNs (calbindin, grey) tartiibaan dhabuu agarsiisan; niwukilasii DAPI tiin counterstained ta’aniiru. (B) Lakkoofsa (A) (xiinxala karaa tokkoon garaagarummaa, ***P <0.001; n = 4 hanga 6 geengoo hantuuta sadii irraa). (C) Adeemsa hojii yaalii. (D) Raabsa kaartaa ho’aa mallattoolee Purkinje (gubbaa) fi gosoota seelii biroo (giddugaleessa) adda ta’an. (E) Diyaagirama Venn baay’ina pirootiinota maaytookondriyaa PN ramadame keessatti adda baafaman agarsiisu. (F) Plootii volkaanoo pirootiinota garaagarummaadhaan ibsaman niwuroonota Mfn2cKO keessatti torban 8 keessatti (gatii kutaa barbaachisummaa 1.3). (G) Xiinxalli karaa kalaqaa karaalee shan kanneen barbaachisoo ta’an shan ol-regulation (diimaa) fi down-regulation (blue) Mfn2cKO PN keessatti torban 8tti ramadaman agarsiisa. Sadarkaan ibsa giddugaleessaa pirootiinii tokkoon tokkoon isaanii argame agarsiifameera. Kaartaa ho’aa iskeelii halluu: gatii P sirreeffame. ns, barbaachisaa miti.
Daataan pirootiyoomiksii akka agarsiisutti ibsi pirootiinii kompileeksoota I, III fi IV suuta suutaan hir’achuu isaati. Kompileeksoonni I, III, fi IV hundi isaanii subunitii mtDNA-encoded barbaachisoo kan qaban yoo ta’u, kompileeksoonni II, kan koodii niwukilaraa qofa qabu, bu’uuraan dhiibbaa hin geessisne (Fakkii 2A fi Fakkii S2A). . Bu'aa proteomics wajjin kan walsimu, immunohistochemistry kutaalee tishuu cerebellar sadarkaan subunit MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) kompileeksii IV PN keessatti suuta suutaan hir'achuu agarsiise (Fakkii 2B). MtDNA-encoded subunit Mtatp8 baay'ee hir'ate (Fakkii S2A), sadarkaan haala tasgabbaa'aa niwukilarii-encoded ATP synthase subunit hin jijjiiramne hafe, kunis beekamaa tasgabbaa'aa ATP synthase subassembly F1 kompileeksii yeroo mtDNA ibsi tasgabbaa'aa ta'e waliin walsima. Uumamni isaa walsimaadha. Addaan cituu (7). Madaalliin sadarkaa mtDNA PN Mfn2cKO sassaabaman keessatti yeroo dhugaa poliimeereezii sansalataa (qPCR) tiin lakkoofsi kooppii mtDNA suuta suutaan hir’achuu mirkaneesse. Garee to’annoo wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu, umurii torban 8tti, sadarkaa mtDNA gara %20 qofatu qabame (Fakkii 2C). Bu'aawwan kanaan walsimuun, confocal microscopy staining Mfn2cKO PNs DNA adda baasuuf fayyadameera, yeroo irratti hundaa'e fayyadama niwuukilootaayidii maaytookondriyaa agarsiisa (Fakkii 2D). Lonp1, Afg3l2 fi Clpx, fi OXPHOS complex assembly factors dabalatee kaadhimamaa tokko tokko qofti pirootiinii maaytookondriyaa diigamuu fi deebii dhiphina keessatti hirmaatan up-regulated akka turan arganne. Sadarkaa pirootiinota apoptosis keessatti hirmaatan irratti jijjiiramni guddaan hin argamne (Fakkii S2B). Haaluma walfakkaatuun, maaytookondriyaa fi endoplasmic reticulum channels geejjibaa kaalsiyeemii keessatti hirmaatan jijjiirama xiqqaa qofa akka qaban arganne (Fakkii S2C). Dabalataanis, madaalliin pirootiinota otoofaajii wajjin walqabatan jijjiirama guddaa hin arganne, kunis induction mul'ataa otoofaagosoomii immunohistochemistry fi electron microscopy in vivo keessatti ilaalame waliin walsima (Fakkii S3). Haa ta’u malee, PNs keessatti OXPHOS dysfunction guddachaa dhufe jijjiirama ultrastructural mitochondrial ifa ta’een kan deemudha. Tuutni maaytookondriyaa qaama seelii fi muka deendriitii Mfn2cKO PNs torban 5 fi 8 keessatti mul’achuu kan danda’an yoo ta’u, caasaan meembraanii keessaa jijjiirama gadi fagoo keessa darbeera (Fakkii S4, A fi B). Jijjiirama ultrastructural kanaa fi mtDNA hir'ina guddaa wajjin kan walsimu, xiinxalli acute cerebral cerebellar slices tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) waliin Mfn2cKO PNs keessatti dandeettiin meembraanii maaytookondriyaa baay'ee hir'achuu agarsiise (Fakkii S4C).
(A) Xiinxala adeemsa yeroo sadarkaa ibsa kompileeksii OXPHOS. Pirootiinota torban 8 keessatti P<0.05 qaban qofa ilaaluu (two-way ANOVA). Sarara tuqaa: CTRL wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu sirreeffamni hin jiru. (B) Bitaa: Fakkeenya kutaa sammuu farra qaama farra-MTCO1 (scale bar, 20 μm) tiin mallatteeffame. Naannoo qaamolee seelii Purkinje qabate keelloodhaan uwwifameera. Mirga: Sadarkaa MTCO1 baay'isuu (xiinxala karaa tokkoon garaagarummaa; n = 7 hanga 20 seelii hantuuta sadii irraa xiinxalame). (C) xiinxala qPCR lakkoofsa waraabbii mtDNA PN sassaabame keessatti (xiinxala karaa tokkoon garaagarummaa; n = hantuuta 3 hanga 7). (D) Bitaa: Fakkeenya cirracha sammuu kan farra qaama farra DNAtiin mallatteeffame (barruu iskeelii, 20 μm). Naannoo qaamolee seelii Purkinje qabate keelloodhaan uwwifameera. Mirga: Lakkoofsa madaa mtDNA (xiinxala karaa tokkoon garaagarummaa; n = 5 hanga 9 seelii hantuuta sadii irraa). (E) Fakkeenya kutaa cerebellar acute kan seelota mitoYFP + Purkinje (xiyya) galmee kilaampii paatch seelii guutuu keessatti agarsiisu. (F) Baay’ina kaarvii IV. (G) Galmeewwan bakka bu’oota seelota CTRL fi Mfn2cKO Purkinje keessatti lilmoo kaarentii depolarizing. Top trace: Puulsii jalqabaa AP kakaase. Hordoffii jalaa: Firikuweensii AP ol’aanaa. (H) Galtee ofumaan booda sinaaptikii (sPSPs) baay’isuu. Hordoffiin galmee bakka bu’aa fi reeshiyoon guddina isaa (I) keessatti agarsiifameera. Xiinxalli karaa tokkoon garaagarummaa hantuuta sadii irraa seelii n = 5 hanga 20 xiinxaleera. Odeeffannoon akka giddugaleessa±SEMtti ibsama; *P<0.05; **P<0.01 kan jedhu; ***P<0.001 ta'a. (J) Bakka bu’oota hordoffii AP ofumaan galmaa’e haala perforated patch clamp fayyadamuun. Hordoffii gubbaa: Firikuweensii AP ol’aanaa. Hordoffii jalaa: guddisuu AP tokkoo. (K) Giddugaleessaa fi firikuweensii AP guddaa akkaataa (J) tiin safara. Qormaata Mann-Whitney; Seelonni n = 5 hantuuta afur irraa xiinxalamaniiru. Odeeffannoon akka giddugaleessa±SEMtti ibsama; barbaachisaa miti.
Miidhaan OXPHOS ifa ta’e torban 8 Mfn2cKO PN keessatti argameera, kunis hojiin fiiziyoloojii niwuroonotaa baay’ee kan hin baramne ta’uu agarsiisa. Kanaaf, nuyi amala elektirikii darbaa niwuroonota OXPHOS-hir'ina qaban torban 4 hanga 5 fi torban 7 hanga 8tti galmee seelota guutuu patch clamp acute cerebellar slices keessatti raawwachuudhaan xiinxalle (Fakkii 2E). Akka hin eegamnetti, giddu galeessaan boqonnaa meembraanii dandeettii fi galtee mormii niwuroonota Mfn2cKO to'annoo wajjin walfakkaata ture, garaagarummaa xixiqqoo seelii gidduutti jiraatus (Gabatee 1). Haaluma walfakkaatuun, umurii torban 4 hanga 5tti hariiroo kaarentii-voolteejii (IV curve) irratti jijjiiramni guddaan hin argamne (Fakkii 2F). Haa ta’u malee, niwurooniin Mfn2cKO torban 7 hanga 8 ta’e tokkollee sirna IV (tarkaanfii haayperpoolaarizeeshinii) irraa lubbuun hafe, kunis sadarkaa boodaa kana irratti dandeettii haayperpoolaarizeeshinii irratti miira ifa ta’e akka jiru agarsiisa. Faallaa kanaatiin, niwuroonota Mfn2cKO keessatti, kaarentoonni depolarizing kanneen dhangala’aa pooteenshaala gocha irra deddeebi’aa (AP) fidan akka gaariitti kan dandamaman yoo ta’u, kunis akkaataan dhangala’aa waliigalaa isaanii kan niwuroonota to’annoo torban 8 irraa garaagarummaa guddaa akka hin qabne agarsiisa (Gabatee 1 fi Fakkii 2G). Haaluma walfakkaatuun, frequency fi amplitude spontaneous postsynaptic currents (sPSCs) kan garee to’annoo wajjin wal bira qabamee kan ilaalamu yoo ta’u, frequency taateewwan torban 4 irraa gara torban 5tti gara torban 7 hanga torban 8tti dabaleera walfakkaatuun dabaleera (Fakkii 2, H fi I). Yeroon bilchina sinaaptikii PN keessatti (25). Bu’aan walfakkaataan erga PNs patches bocame booda argameera. Qindaa'inni kun beenyaa mudaa ATP seelii ta'uu danda'u dhorka, akkuma galmee kilaampii paatch seelii guutuu keessatti ta'uu danda'u. Keessattuu, dandeettiin meembraanii boqonnaa fi firikuweensii ofumaan dhukaasaa niwuroonota Mfn2cKO hin tuqamne (Fakkii 2, J fi K). Walumaagalatti, bu’aan kunniin PNn OXPHOS dysfunction ifa ta’e qaban haala dhangala’aa friikuweensii olaanaa akka gaariitti dandamachuu akka danda’an agarsiisu, kunis mala beenyaa deebii elektiroofiiziyoloojii idileetti dhihoo ta’e eeguuf isaan dandeessisu akka jiru agarsiisa.
Odeeffannoon akka giddugaleessa ± SEM (xiinxala karaa tokkoon garaagarummaa, qormaata walmadaalchisuu dachaa Holm-Sidak; *P<0.05) jedhamee ibsama. Lakkoofsi yuunitii qareedhaan agarsiifama.
Nu gosti kamiyyuu kuusaa deetaa pirootiyoomiksii keessatti (Fakkii 1G) karaa hanqina OXPHOS cimaa ofirraa ittisuu danda'u of keessatti hammachuu isaa qorachuuf kaane, kanaanis maaliif PN dhiibbaa irra gahe elektiroofiiziyoloojii naannoo idileetti dhihoo ta'e eeguu akka danda'u ibsa (Fakkii 2, E hanga K). . Xiinxalli pirootiyoomiksii inzaayimoonni kaataabooliizimii amiinoo asiidota sansalata damee (BCAA) keessatti hirmaatan haalaan ol-regulated akka turan agarsiise (Fakkii 3A fi Fakkii S5A), fi oomishni dhumaa aseetiil-CoA (CoA) ykn succinyl CoA marsaa arteriosclerosis Acid (TCA) keessatti tricarboxylates dabaluu danda'a. Qabiyyeen BCAA transaminase 1 (BCAT1) fi BCAT2 lamaan isaanii akka dabale arganne. Isaan α-ketoglutarate irraa glutamate maddisiisuudhaan tarkaanfii jalqabaa BCAA catabolism catalyze ( 26 ). Subunits hunduu kanneen damee sansalata keto acid dehydrogenase (BCKD) complex kompileeksii uumuu upregulated (kompileeksiin booda fi irreversible decarboxylation bu'aa BCAA carbon skeleton catalyzes) (Fakkii 3A fi Fakkii S5A). Haa ta’u malee, jijjiiramni ifa ta’e BCAA mataa isaa irratti PN sassaabame keessatti hin argamne, kunis sababa fudhatama seelii amiinoo asiidota barbaachisoo kanaa dabaluu ykn maddoota biroo (gilukoosii ykn asiidii laktik) fayyadamuun marsaa TCA dabaluu irraa kan ka’e ta’uu danda’a (Fakkii S5B). PNs OXPHOS hin qabnes umurii torban 8tti diigamuu gilutaamiinii fi sochii transamination dabaluu agarsiisan, kunis up-regulation inzaayimoota mitochondrial glutaminase (GLS) fi glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Fakkii 3, A fi C) calaqqisuu danda'a. Up-regulation GLS spliced ​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) qofa irratti kan daangeffame ta'uun isaa hubatamuu qaba (jijjiiramni Mfn2cKO/CTRL tilmaamaan dachaa 4.5, P = 0.05), fi up-regulation addaa isaa tishuuwwan kaansarii keessatti baayoo-anarjii maaytookondriyaa deeggaru danda'a. (27) jedhu.
(A) Kaartaan ho’aa jijjiirama dachaa sadarkaa pirootiinii karaa murtaa’eef torban 8 irratti agarsiisa. (B) Fakkeenya cirracha sammuu farra qaama farra PCx tiin mallatteeffame (barruu iskeelii, 20 μm). Xiyyaan keelloo gara qaama seelii Purkinje agarsiisa. (C) Xiinxala ibsa pirootiinii adeemsa yeroo akka kaadhimamaa barbaachisaa atherosclerosis adda baafame (multiple t-test, *FDR <5%; n = 3-5 mice). (D) Gubbaa: Diyaagirama iskiimaatikii karaalee adda addaa kaarboonii mallatteeffame kan [1-13C]pyruvate tracer keessatti argamu seenuu agarsiisu (jechuunis, karaa PDH ykn karaa trans-arterial). Jalqaba: Chaartiin vaayiliiniin dhibbeentaa kaarboonii mallatteeffame (M1) gara asiidii aspaartikii, asiidii saayitirikii fi asiidii maalikii erga [1-13C]piruveetii (paired t-test; ** P <0.01) slices acute cerebellar mallatteessee booda agarsiisa. (E) Xiinxala seenaa yeroo bal’aa daandii agarsiifame. Pirootinoota P<0.05 qaban qofa torban 8 irratti ilaali . Sarara qaxxaamuraa: gatii sirreeffamaa hin qabu (xiinxala karaa lamaa garaagarummaa; * P <0.05; *** P <0.001). Odeeffannoon akka giddugaleessa±SEM tti ibsama.
Xiinxala keenya keessatti, BCAA catabolism karaa ijoo up-regulation keessaa tokko ta'eera. Dhugaan kun PN OXPHOS hin qabne keessatti ulfaatinni qilleensaa marsaa TCA seenu jijjiiramuu akka danda’u cimsee agarsiisa. Kun bifa guddaa meetaabolii niwuroonii waayiriiring bakka bu’uu danda’a, kunis yeroo kunuunsa hojii dhabuu OXPHOS hamaa ta’etti fiiziyoloojii niwuroonii fi lubbuun jiraachuu irratti dhiibbaa kallatti qabaachuu danda’a. Yaada kanaan kan walsimu, inzaayimii farra-atherosclerotic inni guddaan PCx up-regulated (Mfn2cKO / CTRL tilmaamaan yeroo 1.5 jijjiirama; Fakkii 3A), kunis jijjiirama pyruvate gara oxaloacetate (28) catalyzes, kan tishuu sammuu keessatti akka ta'e amanamu arganne The expression in is restricted to astrocytes (29, 30). Bu'aa proteomics wajjin kan walsimu, confocal microscopy PCx ibsa addatti fi guddaa OXPHOS-hir'ina PNs keessatti dabaluu agarsiise, PCx reactivity irra caalaa seelota Bergmann glial itti aananii to'annoo irratti daangeffame (Fakkii 3B). Hojiidhaan upregulation PCx ilaalame qorachuuf, nu [1-13C]pyruvate tracer waliin acute cerebellar slices wal'aanne. Yeroo piruvate pyruvate dehydrogenase (PDH) tiin oksaayidii ta'e, asxaan isotope isaa bade , Garuu yeroo pyruvate walnyaatinsa vaaskilariitiin meetaabolii ta'u gidduugaleessota marsaa TCA keessatti hammatama (Fakkii 3D). Daataa proteomics keenya deeggaruun, nuti asiidii aspartic Mfn2cKO slices keessatti tracer kana irraa mallattoo baay'ee ilaalle, asiidii sitrikii fi asiidii malic akkasumas adeemsa giddu galeessaa qaban, guddaa ta'uu baatus (Fakkii 3D).
Niwuroonota doopaamiinii hantuuta MitoPark kanneen hojii dhabuu maaytookondriyaa niwuroonota doopaamiinii addatti jiini tiraanskriipshinii faaktarii A (Tfam) maaytookondriyaa balleessuun uumame keessatti (Fakkii S6B), ibsi PCx akkasumas haalaan ol-regulated ture (31), kunis acetone acid arteriosclerosis Mul'achuun dhukkubichaa yeroo hojii dhabuu niwuroonotaatti akka to'atamu agarsiisa OXPHOS qaama keessaa. Inzaayimoonni addaa (32-34) niwuroonota arteriosclerosis wajjin walqabatee ta’uu danda’an keessatti ibsamuu danda’an PNs OXPHOS hin qabne keessatti haalaan ol-regulated ta’uun isaanii hubatamuu qaba, kan akka propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA propionyl-CoA gara succinyl-CoA fi mitochondrial malic 3 (ME3), . kan gaheen isaanii inni guddaan piruveetii malate irraa deebisuu ta’e (Fakkii 3, A fi C) (33, 35). Dabalataanis, inzaayimii Pdk3, kan fosfooraayileetii fi kanaan PDH inactivate godhu keessatti daballii guddaa arganne (36), inzaayimii Pdp1 kan PDH ykn kompileeksii inzaayimii PDH ofii isaatii activate godhu keessatti jijjiiramni tokkollee hin argamne (Fakkii 3A). Walumaagalatti, Mern2cKO PNs keessatti, phosphorylation α1 subunit α (PDHE1α) subunit kan pyruvate dehydrogenase E1 qaama kompileeksii PDH Ser293 keessatti (sochii inzaayimii PDH dhorkuu beekama) guddate ( Fakkii S6C) (Fakkii S6C). Piruveetiin qaqqabummaa ujummoo dhiigaa hin qabu.
Dhumarratti, karaan super serine fi glycine biosynthesis, walqabatee mitochondrial folate (1C) marsaa fi proline biosynthesis (Fakkii 1G fi Fakkii S5C) hundi isaanii akka gabaasaatti, adeemsa activation keessatti haalaan ol-regulated ta'uu isaanii arganne. Tishuuwwan naannoo isaanii jiran hojii dhabuu maaytookondriyaa wajjin ni socho’u (5-7). Xiinxalli konfookaalii daataa pirootiyoomiksii kana deeggaru akka agarsiisutti, PN OXPHOS dhabame keessatti, cirrachoonni sammuu hantuuta torban 8 serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), inzaayimii ijoo marsaa fooleetii maaytookondriyaa ta'eef saaxilamaniiru. Deebii ittisa qaamaa guddaa (Fakkii S5D). 13 CU-glucose-incubated acute cerebellar slices keessatti, yaalii hordoffii meetaabolii daran up-regulation serine fi proline biosynthesis mirkaneesse, flux kaarboonii isoforms gara serine fi proline akka dabale agarsiisa (Fakkii S5E). Walnyaatinsi GLS fi GPT2n jajjabeeffamu walnyaatinsa gilutaameetii gilutaamiinii irraa fi transamination gilutaameetii fi α-ketoglutarate gidduutti waan ta'eef, upregulation isaanii niwuroononni OXPHOS-hir'ina qaban fedhii glutamate dabaluu akka qaban agarsiisa , Kun baayoosintesis piroolinii dabaluu eeguuf kan kaayyeffate ta'uu danda'a (Fakkii S5C). Jijjiirama kanaan faallaa ta'ee, xiinxalli proteomic astrocytes cerebellar hantuuta PN-specific Mfn2cKO irraa karaaleen kun (antiperoxidases hunda dabalatee) ibsa keessatti jijjiirama guddaa akka hin agarsiifne agarsiise, kanaaf agarsiisu Kun metabolic redirection is selective to degraded PN (Fak. S6, D to G).
Walumaagalatti, xiinxalawwan kunniin PN keessatti haalawwan yeroodhaan hojiitti hiikuu karaa meetaabolii addaa mul’isan. Hojiin maaytookondriyaa niwuroonii hin baramne atherosclerosis jalqabaa fi 1C remodeling (Fakkii 3E fi Fakkii S5C), fi jijjiirama tilmaamamuu danda'u illee ibsa I fi IV complexes, jijjiiramni serine de novo synthesis qofa It only became apparent in the late stages. Hojii dhabuu OXPHOS (Fakkii 3E fi Fakkii S5C). Argannoowwan kun adeemsa tartiiba dhiphinni maaytookondriyaa (marsaa 1C) fi saayitoopilaasmii (serine biosynthesis) marsaa TCA keessatti atherosclerosis dabaluu wajjin walitti dhufeenyaan deebii kennuudhaan meetaabolii niwuroonii irra deebi’ee bocu ibsu.
PNn torban 8 OXPHOS-hir'ina qaban sochii kaka'umsa friikuweensii olaanaa eeguu fi deebi'anii walitti hidhamiinsa meetaabolii guddaa keessa darbuun hojii dhabuu maaytookondriyaa beenyaa kaffaluu danda'u. Argannoon kun yeroo kanattillee seelonni kunniin niwuroodegeneration harkisuu ykn ittisuuf gidduu seensaa wal'aansaa argachuu akka danda'an carraa hawwataa kaasa. Barfachuu. Carraa kana gidduu seensaa walaba lamaatiin furre. Mala jalqabaa keessatti, nuyi Cre-hirkataa adeno-associated virus (AAV) vector dizaayinii akka MFN2 filannoodhaan OXPHOS-hir'ina PNs in vivo keessatti ibsamuu danda'u (Fakkii S7A). AAV encoding MFN2 fi fluorescent reporter gene mCherry (Mfn2-AAV) aadaa niwuroonii jalqabaa in vitro keessatti mirkanaa'e, kunis MFN2 haala Cre-hirkataa ta'een akka ibsamu taasisee fi morfoloojii maaytookondriyaa baraare, kanaanis niwuroonota Mfn2cKO keessatti niwuroomuuteeshinii ittise ( Fakkii S7, B, D fi E). Itti aansuudhaan, nuyi stereotactically torban 8 Mfn2-AAV gara cerebellar cortex Mfn2cKO fi hantuuta to'annoo geessuuf yaalii in vivo gaggeessine, hantuuta torban 12 xiinxalle (Fakkii 4A). Hantuutni Mfn2cKO wal’aanamanii du’an (Fakkii 1, A fi B) (16). Vaayirasii dabarsuu in vivo bu'aan isaa filannoo ibsa PN geengoo sammuu tokko tokko keessatti (Fakkii S7, G fi H). Injection AAV to'annoo mCherry qofa ibsu (Ctrl-AAV) sadarkaa niwuroodegeneration bineensota Mfn2cKO irratti dhiibbaa guddaa hin qabu ture. Faallaa kanaatiin, xiinxalli Mfn2cKOs Mfn2-AAV waliin transduced bu'aa eegumsaa guddaa PN seelii layer agarsiise (Fakkii 4, B fi C). Keessattuu, dhangala’aan niwuroonii bineensota to’annoo irraa adda baafamuu kan hin dandeenye fakkaata (Fakkii 4, B fi C, fi Fakkii S7, H fi I). Ibsi MFN1 garuu MFN2 miti du'a niwuroonii baraaruuf walqixa bu'a qabeessa (Fakkii 4C fi Fakkii S7, C fi F), kunis ibsi MFN1 gadameessaa alaa bu'a qabeessa ta'een hanqina MFN2 dabaluu akka danda'u agarsiisa. Xiinxalli dabalataa sadarkaa PN tokkicha irratti Mfn2-AAV baay'inaan ultrastructure mitochondria baraaruu, sadarkaa mtDNA normalized, fi ibsa olaanaa mallattoo farra-angiogenesis PCx duubatti deebisuu agarsiise (Fakkii 4, C hanga E). Inspeekshiniin ijaan hantuuta Mfn2cKO baraaraman haala boqonnaa keessatti haala dhaabbii fi mallattoon sochii qaamaa isaanii (sochii S1 gara S3) fooyya’uu agarsiise. Xumura irratti, yaalii kunniin MFN2 gara PNs OXPHOS keessatti hanqina cimaa qaban keessatti harkifate deebi'ee galchuun fayyadama mtDNA duubatti deebisuu fi atherosclerosis kakaasuuf gahaa ta'uu isaa agarsiisu, kanaanis in vivo keessatti axon degeneration fi du'a niwuroonii ittisa.
(A) Iskimii sagantaa yaalii AAV MFN2 koodii godhu yeroo karaan meetaabolii agarsiifame hojiirra oolu agarsiisu. (B) Fakkiiwwan konfookaalii bakka bu’oota kan torban 12-slices cerebellar hantuuta Mfn2cKO keessatti torban 8tti transduced fi farra-Calbindin antibody mallatteeffame. Mirga: Iskeelii fibers aksoonii. Iskeeliin zoomii aksoonii 450 fi 75 μm dha. (C) Bitaa: Lakkoofsi dhangala’aa seelii Purkinje AAV transduction loop (AAV +) keessatti (xiinxala karaa tokkoon garaagarummaa; n = 3 hantuuta). Mirga: xiinxala xiyyeeffannoo mtDNA PN transduced keessatti torban 12 (unpaired t-test; n = 6 seelii hantuuta sadii irraa). * P <0.05; ** P <0.01 ta’uu isaati. (D) Bakka bu’aa dabarsuu elektiroonii maaykiroogiraafii PN kutaalee Mfn2cKO cerebellar veektarii vaayirasii agarsiifamaniin jijjiirame. Haguuggiin bifa pilaastikii qabu naannoo deendraayitoonni qabate kan agarsiisu yoo ta’u, iskuweeriin tuqaa keelloo qabu ammoo zoomii mirgaa irratti kenname agarsiisa; n niwukilasii bakka bu’a. Barruu iskeelii, 1μm. (E) fakkeenya PCx staining PN torban 12 irratti transduced keessatti agarsiisa. Barruu iskeelii, 20μm. OE, garmalee ibsuu; FC, jijjiirama dachaa.
Dhumarratti, barbaachisummaa lubbuun jiraachuu seelii peroxidase-induced PNs OXPHOS dysfunction mudate keessatti qoranne. Nu mCherry encoding AAV-shRNA (short hairpin RNA) addatti hantuuta PCx mRNA (AAV-shPCx) irratti xiyyeeffate maddisiifne, fi vaayirasicha ykn to'annoo isaa scrambled (AAV-scr) cerebellum hantuuta Mfn2cKO keessatti lilmoo. Yeroo ibsi PCx dabale (Fakkii 3C) fi laayibariin seelii PN ammallee hin tuqamne (Fakkii 1A) keessatti PCx knockdown bu'a qabeessa ta'e galmaan ga'uuf qoricha lilmoo torban afraffaatti (Fakkii 5A) raawwatame. PCx kuffisuun (Fakkii S8A) du’a PN saffisa guddaa fida, kunis ring dhukkuba kanaan qabame qofa irratti kan daangeffame ta’uun isaa hubatamuu qaba (Fakkii 5, B fi C). Akkaataa bu'aa meetaabolii PCx up-regulation kakaase hubachuuf, nuyi haala redox PNs erga PCx knockdown fi AAV-jiddugaleessa optical biosensor Grx1-roGFP2 yeroo tokkotti ibsaman (Fakkii S8, B hanga D) glutathione madaaluuf qoranne Jijjiirama fira dandeettii peptide redox (38). Sana booda, haala FLIM erga mirkaneessinee booda haala reedoksii saayitoopilaasmii keessatti jijjiirama dhufuu danda'u adda baasuuf, slices sammuu cimaa torban 7 Mfn2cKO ykn to'annoo littermates keessatti lama-footoonii fluorescence umurii suuraa microscopy (FLIM) raawwanne. Xiinxalli kun haala oksideeshinii Mfn2cKO PNs tokkoo kan PCx ibsa hin qabne keessatti dabaluu guddaa agarsiise, kunis niwuroonota to'annoo ykn Mfn2cKO PNs shRNA scrambled qofa ibsan irraa adda (Fakkii 5, D fi E). Yeroo PCx ibsi down-regulated ture, dhibbeentaan Mfn2cKO PNs haala oksaayidii olaanaa agarsiisu dachaa sadii ol dabale (Fakkii 5E), PCx up-regulation dandeettii redox niwuroonota degenerated eeguu agarsiisa.
(A) Iskimii sagantaa yaalii AAV shPCx koodii godhu yeroo karaan meetaabolii agarsiifame hojiirra oolu agarsiisu. (B) Suuraalee konfookaalii bakka bu’oota kutaalee sammuu torban 8 hantuuta Mfn2cKO keessatti torban 4tti farra qaama farra kaalsinuuriiniin jijjiiramee fi mallatteeffame. Barruu iskeelii, 450μm. (C) Lakkoofsa dhangala'aa seelii Purkinje AAV-transduced loops keessatti (xiinxala karaa tokkoon garaagarummaa; n = 3 hanga 4 hantuuta). Odeeffannoon akka giddugaleessa±SEMtti ibsama; ***P<0.001 ta'a. (D) Suuraan bakka bu’aa FLIM haala yaalii ibsame jalatti giddugaleessa umurii PN torban 7 kan ibsu glutathione redox sensor Grx1-roGFP2 agarsiisa. LUT (gabatee ilaaluu) reeshiyoo: yeroo lubbuun jiraachuu (picoseconds keessatti). Barruu iskeelii, 25μm. (E) Histogiraamiin raabsa gatiiwwan umurii Grx1-roGFP2 (D) irraa agarsiisa (n=158 hanga 368 seelii hantuuta lama keessatti haala tokkoon tokkoon). Chaartiin paayi tokkoon tokkoon histogiraamii olitti: baay’ina seelii gatii umurii baay’ee dheeraa (diimaa, oksaayidii) ykn gabaabaa (buluu, hir’ate) qaban agarsiisa, kunis gatii umurii giddugaleessaa CTRL-AAV-scr keessatti 1 SD caala. (F) Moodeelli yaadame bu’aa eegumsaa upregulation PCx niwuroonii agarsiisa.
Walumaagalatti, daataa nuti asitti kenninu akka agarsiisutti, irra deebiin ibsamuu MFN2 guutummaatti PN sadarkaa olaanaa hanqina OXPHOS hamaa, mtDNA hamaa hir'achuu, fi morfoloojii ista fakkaatu garmalee hin baramne, kanaanis dhukkuboota sadarkaa olaanaa qaban keessatti illee guddina itti fufiinsa qabu kennuu danda'a. Niwuroodejenereeshiniin sadarkaa du’a seelii dura jiru ragaa duubatti deebi’uu danda’u kenna. Sadarkaan meetaabolii kun dandeettii niwuroononni atherosclerosis (a rewiring of the TCA cycle) kakaasuu isaaniitiin daran cimsa, kunis PNs OXPHOS hin qabne keessatti PCx ibsa dhorkuu fi du'a seelii guddisa, kanaanis gahee eegumsaa taphata (Fakkii 5F).
Qorannoon kun, deebii PNs OXPHOS dysfunction suuta suutaan gara TCA marsaa atherosclerosis karaa differential activation karaa sagantaa meetaabolii activated ta'uu isaa ragaa dhiheessine. Xiinxala pirootiyoomii mala dabalataa hedduudhaan mirkaneessinee, yeroo rakkoo maaytookondriyaa cimaan qormaata ta'u, niwuroononni bifa kanaan dura hin beekamne kan meetaabolii elastiiksii akka qaban ifa goone. Kan nu ajaa'ibu, adeemsi rewiring guutuun haala meetaabolii xumuraa kan neurodegeneration suuta suutaan fi duubatti hin deebine waliin deemu mallatteessu hin qabu, garuu daataa keenya sadarkaa du'a seelii dura jiru keessattillee niwuroonii suphaa uumuu akka danda'u agarsiisa Functional compensation mechanism. Argannoon kun niwuroononni qaama keessatti pilaastikii meetaabolii sadarkaa guddaa akka qaban agarsiisa. Dhugaan kun boodarra MFN2 deebi’ee galchuun ibsa mallattoolee meetaabolii ijoo duubatti deebisuu fi PN degeneration ittisuu akka danda’u mirkaneessa. Faallaa kanaatiin dhukkuba atherosclerosis dhorkuu fi narvii saffisiisa. saala jijjiirrachuu.
Qorannoo keenya keessatti argannoowwan baay’ee nama hawwatan keessaa tokko PNn OXPHOS hin qabne inzaayimoota addatti arteriosclerosis kakaasan ol-regulating gochuun meetaabolii marsaa TCA fooyyessuu danda’u. Irra deebiin qindaa’uun meetaabolii amala waliigalaa seelii kaansarii yoo ta’u, isaan keessaa tokko tokko gilutaamiinii irratti hirkatanii TCA marsaa gidduugaleessa dabaluudhaan walqixa hir’isuu oomishuuf, isaanis sansalata sirna hargansuu kan oofan fi oomisha lipidii fi niwuukilootaayidii baayoosintesis dursitoota eegu (39 , 40). Qorannoon dhiheenya kana gaggeeffame akka agarsiisutti, tishuuwwan naannoo OXPHOS dysfunction mudatan keessatti, deebi’ee walitti hidhamiinsi meetaaboliizimii glutamine/glutamate akkasumas amala beekamaadha (5, 41), bakka kallattiin glutamine gara marsaa TCA seenu Sababa hamma miidhaa OXPHOS (41) irratti hundaa’a. ). Haa ta’u malee, walfakkeenya pilaastika meetaabolii niwuroonii qaama keessatti fi barbaachisummaa isaa haala dhukkubaa keessatti ta’uu danda’u irratti ragaan ifa ta’e hin jiru. Qorannoon dhiheenya kana in vitro gaggeeffame keessatti, niwuroononni kortikaalii jalqabaa niwurootransmishiniif poolii gilutaameetii akka sochoosan agarsiifameera, kanaanis haala dhiphina meetaabolii jalatti meetaabolii oksijiinii fi atherosclerosis akka guddisu ( 42 ). Kan hubatamuu qabu, dhorkaa farmaakooloojii inzaayimii marsaa TCA succinate dehydrogenase jalatti, pyruvate carboxylation walnyaatinsa oxaloacetate niwuroonota cerebellar granule aadaa keessatti akka eegu amanama ( 34 ). Haa ta’u malee, barbaachisummaan fiiziyoloojii malawwan kanaa tishuu sammuu (bakka atherosclerosis irra caalaa astrocytes qofa irratti daangeffame jedhamee amanamu) ammallee hiika fiiziyoloojii barbaachisaa qaba (43). Haala kana keessatti, daataa keenya akka agarsiisutti PNs OXPHOS qaama keessatti miidhaman gara BCAA diigamuu fi pyruvate carboxylation, kanneen madda ijoo lamaan dabalata TCA pool intermediates ta'etti jijjiiramuu danda'u. Gumaacha tilmaamame BCAA catabolism meetaabolii anniisaa niwuroonii yaadame ta'us, gahee glutamate fi GABA neurotransmission ( 44 ) malees, ammallee ragaan mala kanaaf in vivo hin jiru. Kanaafuu, PNn hojii hin hojjenne ofumaan fayyadama gidduugaleessota TCA adeemsa assimilation tiin oofan atherosclerosis dabaluudhaan beenyaa kaffaluu akka danda’an tilmaamuun salphaadha. Keessattuu, upregulation PCx fedhii asiidii aspartic dabale eeguuf barbaachisuu danda'a, kunis seelii baay'inaan maaytookondriyaa dysfunction qaban keessatti yaada ( 45 ). Haa ta'u malee, xiinxalli meetabolomiksii keenya sadarkaa haala tasgabbaa'aa asiidii aspartic Mfn2cKO PNs keessatti jijjiirama guddaa hin mul'isne (Fakkii S6A), kunis akka tilmaamaatti itti fayyadama meetaabolii adda addaa asiidii aspartic seelii baay'ee fi niwuroonota post-mitotic gidduutti calaqqisiisa . Malli sirrii PCx upregulation niwuroonota dysfunctional in vivo keessatti amala qabaachuu kan hafu ta'us, deebii yeroo malee kun haala redox niwuroonotaa eeguu keessatti gahee guddaa akka qabu agarsiifne, kunis yaalii FLIM cerebellar slices irratti agarsiifame. Keessattuu, PNn PCx akka ol hin to’anne ittisuun haala oksaayidii caalaa fiduu fi du’a seelii saffisiisuu danda’a. Activation BCAA degradation fi carboxylation pyruvate karaa amala tishuuwwan naannoo mitochondrial dysfunction miti ( 7 ). Kanaafuu, isaan amala dursa niwuroonota OXPHOS-hir'ina qabaniif fakkaatu, yoo amala tokkicha ta'uu baatellee, kunis niwuroodegenereeshiniif barbaachisaa dha. .
Dhukkubni sammuu gosa dhukkuba niwuroodegenereeshinii heterogeneous yoo ta’u yeroo baay’ee akka ataxia tti kan mul’atu yoo ta’u yeroo baay’ee PNs kan miidhudha (46). Uummanni niwuroonii kun keessumaa hantuuta keessatti filannoodhaan manca’uun isaanii mallattoolee sochii qaamaa kanneen amala ataksii ispiinosereebeelarii namaa ta’an hedduu baay’isuuf gahaa waan ta’eef hojii dhabuu maaytookondriyaatiif saaxilamaadha (16, 47, 48). Akka gabaasaaleen jedhanitti, moodeelli hantuutaa jijjiirraa jiinii jiini mutant qabu ataxia ispiinocerebellar namaa wajjin kan walqabatu yoo ta’u, maaytookondriyaa dysfunction qaba ( 49 , 50 ), kunis barbaachisummaa bu’aa hanqina OXPHOS PNPH keessatti qorachuu cimsee ibsa. Kanaafuu, keessumaa baay’ina niwuroonota adda ta’e kana bu’a qabeessa ta’een adda baasuu fi qorachuun mijataadha. Haa ta'u malee, PNn dhiibbaa irratti baay'ee miira qabeessa ta'uu fi guutummaa uummata seelii sammuu keessaa qooda xiqqaa ta'uu isaanii yoo ilaalle, qorannoowwan omics irratti hundaa'an hedduudhaaf, filannoodhaan akka seelii guutuutti addaan bahuun ammallee gama qormaataa dha. Faalama gosoota seelii biroo (keessattuu tishuuwwan ga'eessotaa) guutummaatti hanqina argachuun kan hin danda'amne ta'us, nuyi FACS waliin tarkaanfii addaan ba'uu bu'a qabeessa walitti makuun xiinxala proteomics downstream'f niwuroonota jiraachuu danda'an lakkoofsa gahaa argachuuf, fi uwwisa pirootiinii Quite ol'aanaa (gara pirootiinota 3000) tuuta deetaa jiruun guutummaa cerebellum (51) wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu qabna. Jireenya seelii guutuu eeguun, malan nuti asitti kenninu jijjiirama karaa meetaabolii maaytookondriyaa keessatti mul'atu sakatta'uu qofa osoo hin taane, jijjiirama gita isaa saayitoopilaasmii sakatta'uuf nu dandeessisa, kunis gosa seelii badhaadhessuuf itti fayyadama mallattoolee meembraanii maaytookondriyaa dabalata Malli haaraan baay'ina maaytookondriyaa tishuuwwan walxaxaa keessatti (52, 53). Malli nuti ibsinu qorannoo seelii Purkinje qofa waliin kan walqabatu osoo hin taane, jijjiirama meetaabolii sammuu dhukkubsate keessatti mul'atu furuuf gosa seelii kamiyyuu irratti salphaatti hojiirra oolchuun ni danda'ama, kunis moodeelota biroo hojii dhabuu maaytookondriyaa dabalatee.
Dhumarratti, adeemsa irra deebiin qindeessuu meetaabolii kana keessatti foddaa wal'aansaa mallattoolee ijoo dhiphina seelii guutummaatti duubatti deebisuu fi manca'iinsa niwuroonii ittisuu danda'u adda baasneerra. Kanaafuu, dhiibbaa dalagaa wiirtuu asitti ibsame hubachuun yeroo hojii dhabuu maaytookondriyaa jireenya niwuroonii eeguuf wal'aansoowwan ta'uu danda'an irratti hubannoo bu'uuraa kennuu danda'a. Qorannoon gara fuula duraatti jijjiirama meetaabolii anniisaa gosoota seelii sammuu biroo keessatti mul’atu addaan kutuuf kaayyeffate, hojiirra oolmaa seera bu’uuraa kanaa dhukkuboota niwurooloojikaalaa biroo irratti guutummaatti mul’isuuf barbaachisaadha.
Hantuutni MitoPark kanaan dura ibsameera ( 31 ). Hantuutni C57BL/6N jiiniiwwan Mfn2 cinaacha loxP qaban kanaan dura ibsameera (18) fi hantuuta L7-Cre waliin qaxxaamuraniiru (23). Sanyiiwwan dachaa heterozaayigoosii bu’aa argatan sana booda hantuuta homozaayigoosii Mfn2loxP/Mfn2loxP waliin qaxxaamuranii Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre)’f jiini Purkinje-specific knockouts maddisiisan. Tuuta xiqqaa walhormaataa keessatti, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (stop-mtYFP) karaa qaxxaamuraa dabalataa (20) galfame. Hojimaatni bineensotaa hundi akkaataa qajeelfama Awurooppaa, biyyaalessaa fi dhaabbileetiin kan raawwatame yoo ta’u, LandesamtfürNatur kan Umwelt fi Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany irraa mirkanaa’eera. Hojiin bineensotaas qajeelfama Federeeshinii Waldaalee Saayinsii Beeyladaa Laaboraatoorii Awurooppaa hordofa.
Dubartii ulfaa kana erga anesthetize godhanii booda, miciree hantuutaa adda baafama (E13). Korteeksiin Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Hepes 10 mM dabalamee keessatti cicciramee Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium kan papain (20 U/ml) fi cysteine ​​(1μg/ml) of keessaa qabu irratti darbe. Tishuu DMEM keessatti inkuubeer gochuu) fi bullaa’insa inzaayimiitiin addaan baasuu. Ml) 37°C irratti daqiiqaa 20f, achiis DMEM seerumi loonii mucaa gadameessaa %10n dabalamee keessatti makaanikaalatti daaku. Seelonni xiinxala suuraatiif haguuggii geejjibaa poliilaayiziniin dibame irratti dhangala’aa 2×106 saanii aadaa seentimeetira 6 tokkotti ykn dhangala’aa seelii 0.5×105/cm2 irratti facaafaman. Sa’aatii 4 booda, meediyaan kun meediyaa seerumi Neurobasal irraa bilisa ta’ee fi dabalata B27 %1 fi GlutaMax 0.5 mM of keessaa qabuun bakka bu’eera. Sana booda niwuroononni yaalii guutuu 37°C fi 5% CO2 irratti kan eegaman yoo ta’u, torbanitti al tokko nyaachifamaniiru. In vitro keessatti irra deebiin walitti makamuu kakaasuuf, 3μl (24-well culture dish) ykn 0.5μl (24-well plate) veektarii vaayirasii AAV9 armaan gadii guyyaa lammaffaa in vitro keessatti niwuroonota wal’aanuuf itti fayyadameera: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, lakkoofsa kataloogii 105530-AAV9) fi AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, lakkoofsa kataloogii 105545-AAV9).
DNA dabalataa Mfn1 fi Mfn2 hantuutaa (pilaasmiidii Addgene #23212 fi #23213 irraa argame, akkaataa wal duraa duubaan) tartiiba V5 (GKPIPNPLLGLDST) C-terminus irratti mallatteeffamanii, fi mCherry waliin frame keessatti karaa tartiiba T2A walitti makamaniiru. Grx1-roGFP2 kennaa Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) irraa argamedha. Mala kloonii barame fayyadamuun kaaseetii tdTomato bakka buusuun, kaasetiin gara lafee dugdaa pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (Lakkoofsa wabii Addgene 28306) keessatti subkloonii ta’ee pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 fi Veektaroota pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Tooftaa walfakkaataan veektarii to’annoo pAAV-CAG-FLEX-mCherry maddisiisuudhaaf itti fayyadameera. Ijaarsa AAV-shPCx maddisiisuudhaaf, veektarii pilaasmiidii AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) barbaachisa, kunis tartiiba DNA kan shRNA hantuuta PCx irratti xiyyeeffate koodii godhu (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG) of keessaa qaba 3′) To’annoo piroomootara U6 jalatti mCherry to’annoo piroomootara CMV jalatti fayyadama. Omishni veektarii AAV gargaaraa akkaataa qajeelfama oomishtootaatiin (Cell Biolabs) raawwatameera. Gabaabumatti, pilaasmiidii dabarsoo mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) yeroodhaaf Transfection of 293AAV cells-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ykn Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) koodii jiini, akkasumas koodii pirootiinii kaapsidii AAV1 fi pirootiinii gargaaraa Paakeejiing pilaasmiidii pilaasmiidii, mala kaalsiyeemii fosfeetii fayyadamuun. Suppernaataantiin vaayirasii jal’aa marsaa freeze-thaw bath ice/ethanol goggogaa fi seelii lysed phosphate buffered saline (PBS) keessatti argameera. Veektariin AAV altiraaseetiriifiigeeshinii ayoodiksaanool giraadiyeentii walitti fufiinsa hin qabneen (sa’aatii 24 32,000 rpm fi 4°C irratti) qulqullaa’ee filtara seentirifuugal Amicon ultra-15 fayyadamuun walitti qabame. Tiitara jiinoomii AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 waraabbii jiinoomii (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX akkuma kanaan dura ibsametti ture (54), yeroo dhugaa PCR (qPCR) tiin safarame. -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) fi AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) ta’uu ibsameera.
Niwuroononni jalqabaa 1x PBS qorraa akka cabbii keessatti ciramanii, pelleted, achiis 0.5% Triton X-100 / 0.5% soodiyeem deoxycholate/PBS lysis buffer phosphatase fi protease inhibitor (Roche) of keessaa qabu keessatti homogenized turan. Lakkoofsi pirootiinii qorannoo asiidii baayisiinkooniik (Thermo Fisher Scientific) fayyadamuun raawwatameera. Sana booda pirootinoonni kunneen SDS-polyacrylamide gel electrophoresis tiin adda baafamaniiru, achiis meembraanii polyvinylidene fluoride (GE Healthcare) irratti blotted. Bakka adda hin taane ugguruu fi farra qaama jalqabaa (bal’ina isaaf gabatee S1 ilaali) aannan %5 TBST keessatti (Tris-buffered saline with Tween), tarkaanfii dhiqannaa fi farra qaama lammaffaa TBST Incubate keessatti inkuubeer gochuu. Farra qaama jalqabaa waliin halkan tokkoof +4°C irratti inkuubeer gochuu. Erga dhiqannee booda farra qaama lammaffaa sa’aatii 2f ho’a kutaa keessatti dibachuu. Itti aansuudhaan, bilootii walfakkaataa farra qaama farra-β-aktiin waliin inkuubeer gochuun, fe’iinsi walfakkaataan mirkanaa’eera. Gara keemilumineesansitti jijjiiruun fi keemilumineesensii guddisuudhaan adda baasuu (GE Healthcare).
Niwuroononni kanaan dura haguuggii geejjibaa irratti facaafaman yeroo murtaa’etti teempireechara kutaa keessatti daqiiqaa 10f paaraafoormaaldihaydii (PFA)/PBS %4n dhaabbataniiru. Haguuggii jalqaba 0.1% Triton X-100/PBS daqiiqaa 5f teempireechara kutaa keessatti, achiis blocking buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS] keessatti kan guutaman ta’a. Guyyaa lammaffaatti, coverslips blocking buffer tiin dhiqamee, farra qaama lammaffaa fluorophore-conjugated sirrii ta’een sa’aatii 2f ho’a kutaa keessatti inkuubeer ta’e; dhumarratti, saamuda PBS keessatti 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) waliin sirriitti dhiqamaniiru, sana booda Aqua-Poly/Mount tiin islaayidii maaykirooskooppii irratti dhaabbata.
Hantuutni (dhiiraa fi dubara) ketamine (130 mg/kg) fi xylazine (10 mg/kg) intraperitoneal injection tiin anesthetized fi carprofen analgesic (5 mg/kg) gogaa jalatti kenname , Fi meeshaa stereotactic (Kopf) pad ho'aa qabu keessa kaa'ame. Mataa saaxiluu fi qotiinsa ilkaan fayyadamuun kutaa korteeksii sammuu lafee mis wajjin walsimu (lambda irraa: funyaan 1.8, cinaachaa 1, lobules IV fi V wajjin walsimu) qallachuu. Ujummoolee dhiigaa armaan gadii akka hin jeeqneef of eeggannoodhaan boolla xiqqaa mataa keessatti uumuuf cirracha siriinjii qaxxaamuraa fayyadamuu. Sana booda kaappilaariin geejjibaa haphiin harkifame suuta suutaan boolla maaykiroo (gama veentraal dura mater irratti -1.3 hanga -1) keessa galfama, AAV 200 hanga 300 nl siriinjii harkaan (Narishige) yeroo hedduu dhiibbaa gadi aanaadhaan yeroo foddaa daqiiqaa 10 hanga 20 keessatti maaykiroo-injeektara (Narishige) keessatti lilmoodhaan naqama. Erga infuushinii booda, vaayirasichi guutummaatti akka babal’atuuf kaappilaarii daqiiqaa 10 dabalataaf kaa’uu. Erga kaappilaaronni baafamanii booda gogaan of eeggannoodhaan kan suture ta’ee inflammation madaa xiqqeessuu fi bineensichi akka fayyu taasisa. Bineensonni kun baqaqsanii hodhuu booda guyyoota hedduudhaaf qoricha dhukkubbii namatti fidu (caspofen) jedhamu fayyadamuun kan yaalaman yoo ta’u, yeroo kana keessatti haalli qaama isaanii of eeggannoodhaan hordofamee yeroo ibsametti ajjeefamaniiru. Hojimaatni hundi akkaataa qajeelfama Awurooppaa, biyyaalessaa fi dhaabbileetiin kan raawwatame yoo ta’u, LandesamtfürNatur kan Umwelt fi Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany irraa mirkanaa’eera.
Beeyladootni ketamine (100 mg/kg) fi xylazine (10 mg/kg) tiin kan anesthetized ta’an, onneen jalqaba 0.1 M PBS, achiis 4% PFA PBS keessatti perfused ta’e. Tishuun kun cicciramee 4% PFA/PBS keessatti halkan tokkoof 4°C irratti dhaabbataa ture. PBS keessatti sammuu dhaabbataa irraa kutaalee saajiitaalaa (furdina 50 μm) qopheessuuf cirracha raafama (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) fayyadameera. Yoo haala biraatiin ibsame malee, kutaalee bilisaan yaa’an akka armaan olitti ibsametti (13) ho’a kutaa keessatti faaluu fi sochoosuun raawwatameera. Gabaabumatti, jalqaba, cileewwan argaman 0.5% Triton X-100/PBSn daqiiqaa 15f ho’a kutaa keessatti permeabilized turan; epitopes tokko tokkoof (Pcx fi Shmt2), by in tris-EDTA buffer at 80°C (PH 9) tarkaanfii kana dhiisanii daqiiqaa 25f slices ho’isuu. Itti aansuudhaan, kutaaleen farra qaama jalqabaa (Gabatee S1 ilaali) waliin baafaara ugguraa (3% BSA/PBS) keessatti halkan tokkoof 4°C irratti sochoosuun inkuubeer ta’aniiru. Guyyaa itti aanutti kutaaleen sun baafaara ugguraan dhiqamuun farra qaama lammaffaa fluorophore-conjugated sirrii ta’een sa’aatii 2f ho’a kutaa keessatti inkuubeer ta’aniiru; dhumarratti, kutaaleen PBS keessatti sirriitti dhiqamaniiru, DAPIn counter-stained, achiis AquaPolymount On a microscope sliden dhaabbataniiru.
Saamuda kana suuraa kaasuuf maaykirooskooppii konfookaalii laayizerii skaaniin (TCS SP8-X ykn TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) kan laayizerii ifa adii fi laayizerii altiraavaayoleetii daayoodi 405 qabu fayyadameera. Fluorophore kakaasuu fi mallattoo Hybrid Detector (HyDs) tiin walitti qabuudhaan, sooftiweeriin LAS-X fakkiiwwan tuulaman haala tartiibaan saamuda Nyquist wajjin walsimu walitti qabuuf itti fayyadameera: paanaalii baay’ina hin taaneef, mallattoolee daayinamikii olaanaa dha (fakkeenyaaf, seelii soomaatikii fi deendraayitii keessatti) mtYFP) Lakkoofsa PN haala BrightR keessatti adda baasuuf HyD fayyadami). Duubbee hir'isuuf 0.3 hanga 6 ns tti gating hojiirra oola.
Suuraa yeroo dhugaa seelii sassaabame. Erga meediyaa Neurobasal-A dabalata B27 %1 fi GlutaMax 0.5 mM of keessaa qabu keessatti sassaabamee booda, seelonni battalumatti islaayidoota geejjibaa poly-l-lysine-coated irratti facaafaman (μ-Slide8 Well, Ibidi, lakkoofsa kataloogii 80826) , Sana booda seelonni akka qubatan gochuuf sa’aatii 1f 37°C fi CO2 %5 irratti kaa’aniiru. Suuraan yeroo dhugaa kan raawwatame maaykirooskooppii konfookaalii skaaniin laayizerii Leica SP8 kan laayizerii adii, HyD, 63×[1.4 numerical aperture (NA)] oil objective lens fi sadarkaa hoo’isuun hidhate irratti ture.
Hantuutni dafee kaarboon daayi’oksaayidiin anesthetized ta’ee mataa irraa murame, sammuu dafee mataa irraa baafamee, furdina 200μm (yaalii asxaa 13C tiif) ykn furdina 275μm (yaalii footoonii lamaaf) kutaa sagittal meeshaalee armaan gadiitiin guutame The ice cream (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) . wantoota armaan gadiitiin kan guutame yoo ta’u: 125 mM qorra bubbee, kaarbooniin guutame (95% O2 fi 5% CO2) Ca2 gadi aanaa + dhangala’aa sammuu lafee dugda namtolchee (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM soodiyeem fosfeetii baafaara, 25 mM NaHCO3, 25 mM gilukoosii, 0.5 mM CaCl2 fi 3.5 mM MgCl2 (dhiibbaa osmootikii 310 hanga 330 mmol). Cileewwan sammuu argaman gara golee inkuubeshinii duraa Ca2 + ACSF ol’aanaa (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM soodiyeem fosfeetii baafaara, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-gilukoosii, 1.0 mM CaCl2 fi 2.0 mM MgCl2) of keessaa qabutti dabarsuu. Giddugaleessa) pH 7.4 fi 310 hanga 320 mmol).
Adeemsa suuraa keessatti, slices gara kutaa suuraa adda ta'etti kan geeffaman yoo ta'u, yaalii ACSF perfusion walitti fufiinsa qabu jalatti ho'a dhaabbataa 32° hanga 33°C irratti raawwatameera. Maaykirooskooppii maltifootoonii leezari skaaniin (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) kan Leica 25x objective lens (NA 0.95, bishaan), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent) qabu suuraa slice kaasuuf fayyadameera. Moojuulii FLIM (PicoHarp300, PicoQuant) jedhamuun beekama.
FLIM kan Grx1-roGFP2. Jijjiiramni haala reedoksii saayitoopilaasmii PNs FLIM footoonii lamaatiin sagittal brain slices keessatti safarame, bakka Grx1-roGFP2 biosensor PNs irratti xiyyeeffate. Laayibara PN keessatti, dirree argachuu gara 50 hanga 80 μm fuula slice gadiitti filatamee PN jiraachuu danda'u (jechuunis, hanqina caasaa beaded ykn jijjiirama morfoloojii niwuroonii karaa dendrites) fi dachaa pozaatiivii roGFP2 sensara fi AAV encoding shRNA PCx ykn tartiiba to'annoo isaa (tokkoon tokkoon mCherry waliin ibsu) akka jiru mirkaneessuuf. Fakkiiwwan tuullaa tokkoo 2x digital zoom [excitation wavelength: 890 nm; 512 nm 512 piikselii]. Adda baasuu: HyD keessoo, garee filtaraa fluorescein isothiocyanate (FITC)] fi suuraa daqiiqaa 2 hanga 3 keessatti giddugaleessa gochuun footoononni gahaan akka walitti qabaman (walumaagalatti footoonii 1000) kaarvii walsimsiisuuf fayyadamu. Miiraan qorannoo Grx1-roGFP2 fi mirkaneessuun haala FLIM gatii umurii roGFP2 hordofuudhaan raawwatame yeroo exogenous 10 mM H2O2 perfusion ACSF irratti dabaluudhaan (oksaayidii guddisuuf, bu'aan isaa umurii dabaluu), fi sana booda 2 mM dithiothreitol dabaluudhaan (sadarkaa hir'isuu xiqqeessa, bu'aan isaa hir'ina umurii jireenyaa keessatti) (Fakkii S8, D hanga G). Bu’aa argame xiinxaluuf sooftiweeri FLIMfit 5.1.1 fayyadamuun, kaarvii manca’iinsa eksaapooneenshiyaalii tokkicha fakkii guutuu IRF safarame (faankishiniin deebii meeshaa) waliin walsimsiisuu, fi χ2 tilmaamaan 1. Umurii PN tokkoo shallaguuf, haguuggiin naannoo qaama narvii harkaan kaafamee, umriin giddugaleessaa maaskii tokkoon tokkoon isaa keessatti argamu lakkoofsaaf itti fayyadameera.
Xiinxala dandeettii maaytookondriyaa. Kutaan cimaan TMRM 100 nM kallattiin ACSF perfused irratti dabalamee daqiiqaa 30f erga inkuubeer ta’ee booda, jijjiiramni pooteenshaala maaytookondriyaa PNs maaykirooskooppii footoonii lamaatiin safarameera. Suuraan TMRM kan raawwatame qorannoo 920 nm irratti kakaasuu fi HyD keessoo (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) fayyadamuun mallattoo walitti qabuun; dheerina dalgee kaka’umsaa walfakkaataa fayyadamuun garuu HyD keessoo adda ta’e (FITC :525/50) fayyadamuun mtYFP fakkii kaasuun. Sadarkaa seelii tokkootti dandeettii maaytookondriyaa madaaluuf pilaaginii Shallaggii Fakkii ImageJ fayyadami. Gabaabumatti, walqixxummaan pilaagii: mallattoo = min (mtYFP, TMRM) naannoo maaytookondriyaa kan mallattoo TMRM Purkinje Somali keessatti agarsiisu fakkii konfookaalii tuullaa tokkoo kan chaanaalii walgitu keessatti adda baasuuf fayyadama. Sana booda naannoon piikselii haguuggii bu’aa keessatti argamu lakkoofsi isaa ni murtaa’a, achiis fakkii tuullaa tokkoo ujummoo walgitu kan chaanaalii mtYFP irratti normalize ta’ee firaakshinii maaytookondriyaa pooteenshaala maaytookondriyaa agarsiisu argachuuf.
Suuraan kun sooftiweeri Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) jedhamu fayyadamuun kan deconvoluted ta'e. Suuraalee tiles scanned ta'aniif, montage tile tokkoo algorithm automatic stitching software LAS-X tiin kennamu fayyadamuun hojjetama. Erga suuraa safartee booda, ImageJ fi Adobe Photoshop fayyadamuun fakkii sana caalaatti adeemsisuun ifaafi walfaallaa walfakkaataan sirreessuu. Qophii giraafiif Adobe Illustrator fayyadami.
Xiinxala xiyyeeffannoo mtDNA. Lakkoofsi madaa mtDNA kutaalee sammuu farra qaama DNA irratti mallatteeffame irratti maaykirooskooppii konfookaaliin lakkoofsi isaa murtaa’eera. Tokkoon tokkoon naannoo galma qaama seelii fi niwukilasii seelii tokkoon tokkoo isaaniif kan uumame yoo ta’u, naannoon walfakkaataan ammoo Multi Measure plug-in (ImageJ software) fayyadamuun shallagameera. Bal’ina niwukilaraa naannoo qaama seelii irraa hir’isuun naannoo saayitoopilaasmii argachuu. Dhumarratti, Analyze Particles plug-in (ImageJ software) qabxiilee DNA saayitoopilaasmii mtDNA agarsiisan fakkii ujummoo irratti ofumaan safaruuf kan fayyadame yoo ta’u, bu’aan argame giddugaleessa PN hantuuta CTRLtti normalize ta’eera. Bu’aan qorannoo kanaa akka giddugaleessa lakkoofsa niwuukiloosaayidii seelii tokko keessatti ibsama.
Xiinxala ibsa pirootiinii. Sadarkaa seelii tokkootti PN keessatti ibsa pirootiinii madaaluuf pilaaginii ImageJ's Image Calculator fayyadami. Gabaabumatti, fakkii konfookaalii laayibara tokkoo kan chaanaalii walgitu keessatti, karaa walqixxaattoo: mallattoo = min (mtYFP, farra qaama), naannoon maaytookondriyaa kan immunoreactivity farra qaama murtaa’e Purkina keessatti agarsiisu adda baafama. Sana booda naannoon piikselii haguuggii bu’aa keessatti argamu lakkoofsi isaa ni murtaa’a, achiis fakkii tuullaa tokkoo ujummoo walgitu kan chaanaalii mtYFP irratti normalize ta’ee firaakshinii maaytookondriyaa pirootiinii agarsiifame argachuuf.
Xiinxala dhangala’aa seelii Purkinje. Plug-in Lakkaawwii Seelii ImageJ baay’ina seelota Purkinje lakkaa’aman dheerina gingilchaa sammuu seelii lakkaa’amaniin qabameen hiruun dhangala’aa Purkinje madaaluuf itti fayyadameera.
Qophii fi walitti qabuu saamuda. Sammuun garee to’annoo fi hantuuta Mfn2cKO irraa argame 2% PFA/2.5% glutaraldehyde 0.1 M phosphate buffer (PB) keessatti kan dhaabbatan yoo ta’u, sana booda kutaaleen coronal ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) fayyadamuun qophaa’aniiru (Furdina 50 hanga 60 μm) Sana booda PB buffer keessatti 1% os tetraoxide fi 1.5% pootaasiyeem feeroosaayinaayidii ho’a kutaa keessatti sa’aatii 1f. Kutaaleen bishaan distiiliitiin yeroo sadii dhiqamaniiru, achiis etaanoolii %70 kan yuuraaniil aseeteetii %1 of keessaa qabuun daqiiqaa 20f faalamanii turan. Kutaaleen sana booda alkoolii sadarkaa qabu keessatti bishaan irraa hir’ifamanii Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, lakkoofsa kataloogii 14040) keessatti islaayidoota geejjibaa silikooniin dibaman gidduutti kan ukkaamsan yoo ta’u, dhumarratti 60°C irratti sa’aatii 48f foonnicha keessatti Polymerize godhaniiru. Naannoo korteeksii cerebellar filatamee kutaaleen 50 nm ultrathin Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) irratti muramee 2×1 mm copper slit grid film polystyrene tiin dibame irratti fudhatame. Kutaaleen furmaata yuuraaniil aseeteetii %4 H2O keessatti daqiiqaa 10f faalamanii, H2On yeroo hedduu dhiqamaniiru, sana booda Reynolds lead citrate H2O keessatti daqiiqaa 10f dhiqamaniiru, achiis H2On yeroo hedduu dhiqamaniiru. Maaykiroogiraafiin maaykirooskooppii elektiroonii dabarsuu Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digital camera (TVIPS GmbH, Gauting, USA) fayyadamuun fudhatameera. Jarmanii).
Hantuuta AAVn qabamaniif, sammuu addaan baafamee kutaa saajiitaalaa furdina mm 1 qabutti kan ciccirame yoo ta'u, sereebeelamiin maaykirooskooppii fluorescence fayyadamuun gilgaala AAVn faalame (jechuunis mCherry expressing) adda baasuuf qoratameera. Yaalii AAV injection bu’aan isaa gahumsa transduction baay’ee ol’aanaa laayibara seelii Purkinje (jechuunis laayibarii guutuu jechuun ni danda’ama) yoo xiqqaate gilgaalota sammuu walitti aanan lama keessatti qofatu fayyadama. Looppiin AAV-transduced halkan tokkoof post-fixation (4% PFA fi 2.5% glutaraldehyde 0.1 M cocoate buffer keessatti) microdissected fi dabalataan adeemsifame. EPON embedding tiif, tishuun dhaabbataa 0.1 M soodiyeem kookootii baafaaraa (Applichem) tiin dhiqame, fi 2% OsO4 (os, Tajaajila Saayinsii; Caco) waliin 0.1 M soodiyeem kookootii baafaara (Applichem) keessatti Sa’aatii 4 inkuubeer ta’e, sana booda sa’aatii 2f dhiqame. Yeroo 3 irra deebi’i 0.1 M cocamide buffer waliin. Itti aansuudhaan, tartiiba etaanoolii olka’aa tokkoon tokkoon furmaata etaanoolii 4°C irratti daqiiqaa 15f inkuubeer gochuun tishuu bishaan irraa hir’isuuf itti fayyadameera. Tishuun gara pirooppiiliinii oksaayidiitti jijjiiramee halkan guutuu EPON (Sigma-Aldrich) keessatti 4°C irratti inkuubeer ta’e. Tishuu sana EPON haaraa keessa ho’a kutaa keessatti sa’aatii 2f kaa’i, achiis sa’aatii 72f 62°C irratti ukkaamsi. Kutaalee altiraa haphii 70 nm ta’an muruuf altiraamaayikirootoomii (Leica Microsystems, UC6) fi cirracha daayimandii (Diatome, Biel, Switzerland) fayyadamuun, fi yuuraaniil aseeteetii %1.5n daqiiqaa 15f 37°C irratti faaluu, fi furmaata liid saayitreetiitiin daqiiqaa 4 faaluu. Maaykiroogiraafiin elektiroonii kun kan fudhatame maaykirooskooppii elektiroonii dabarsuu JEM-2100 Plus (JEOL) kan Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) fi sooftiweeri DigitalMicrograph (Gatan) fayyadamuun ture. Xiinxalaaf, maaykiroogiraafiin elektiroonii 5000× ykn 10,000× dijiitaalaa zoomiitiin argamaniiru.
Xiinxala morfoloojii maaytookondriyaa. Xiinxala hundaaf, kontooronni maaytookondriyaa dhuunfaa suuraa dijiitaalaa keessatti sooftiweeri ImageJ fayyadamuun harkaan ibsameera. Paaraameetotni morfoloojii adda addaa xiinxalamu. Dandeettiin maaytookondriyaa kan ibsamu bal’ina maaytookondriyaa waliigalaa tokkoon tokkoon seelii naannoo saayitoopilaasmii (bal’ina saayitoopilaasmii = bal’ina naannoo seelii-bal’ina niwukilasii seelii) × 100. Geengoon maaytookondriyaa foormulaa [4π∙(naannoo/naannoo 2)] tiin shallagama. Morfooloojiin ista maaytookondriyaa xiinxalamee akkaataa boca isaanii isa ijootti bakka lamatti (“tubular” fi “blister”) qoodameera.
Xiinxala lakkoofsaa fi dhangala’aa otoofaagoosoomii/layisoomii. Softiweeri ImageJ fayyadamuun kontoorota tokkoon tokkoon otoofaagoosoomii/laayisoosoomii fakkii dijiitaalaa keessatti harkaan ibsuu. Bal’inni otoofaagoosoomii/layisoomii bal’ina caasaa otoofaagoosoomii/layisoomii waliigalaa seelii tokkoon tokkoo naannoo saayitoopilaasmii (bal’ina saayitoopilaasmii=bal’ina seelii-bal’ina niwukilasii)×100n hiruun dhibbeentaa shallagamee ibsama. Dansiin otoofaagoosoomii/laayisoosoomii lakkoofsa waliigalaa baay’ina caasaa otoofaagoosoomii/laayisoosoomii seelii tokkotti (bal’ina saayitoopilaasmiitiin) (bal’ina saayitoopilaasmii = naannoo seelii-bal’ina niwukilaraa) hiruun shallagama.
Asxaa kutaa cimaa fi qophii saamudaa. Yaalii asxaa gilukoosii barbaadaniif, cilee sammuu cimaa gara golee inkuubeshinii duraa, kan kaarboonii guutuu (95% O2 fi 5% CO2), Ca2 + ACSF ol’aanaa (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM soodiyeem fosfeetii baafaara, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM of keessaa qabutti dabarsuu d-gilukoosii, 1.0 mM CaCl 2 fi 2.0 mM MgCl 2, pH 7.4 fi 310 hanga 320 mOsm tti sirreeffame), kan gilukoosii 13 C 6- Bakka bu’iinsa gilukoosii (Eurisotop, lakkoofsa kataloogii CLM-1396) ta’e. Yaalii asxaa pirooveetii barbaadaniif, cilee sammuu cimaa gara Ca2 + ACSF ol’aanaatti (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM soodiyeem fosfeetii baafaara, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-gilukoosii, 1.0 mM CaCl2 fi 2.0mM itti dabaluun dabarsuu MgCl2, pH 7.4 fi 310 hanga 320mOsm sirreessuu), fi 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, lakkoofsa kataloogii CLM-1082) itti dabali. Kutaalee daqiiqaa 90f 37°C irratti inkuubeer gochuu. Xumura yaalii irratti kutaaleen dafanii furmaata bishaanii (pH 7.4) amooniyeemii kaarbooneetii 75 mM of keessaa qabuun dhiqamaniiru, achiis 40:40:20 (v:v:v) aseetoonitraayilii (ACN): meetaanoolii: bishaan keessatti homogenized ta’aniiru. Kutaaleen daqiiqaa 30f bubbee irratti erga inkuubeer ta’anii booda, saamuda 21,000 g irratti daqiiqaa 10f 4°C irratti seentirifuugii, fi supparnaataantiin ifa ta’e konsentreetara SpeedVac keessatti gogfame. Bu’aan isaa peeleetii meetaabolayitii goge hanga xiinxalamutti -80°C irratti kuufameera.
Xiinxala dhangala’aa kiroomaatoogiraafii-mass spectrometry amiinoo asiidota 13 C-labeled. Xiinxala dhangala’aa kiroomaatoogiraafii-mass spectrometry (LC-MS) tiif, peeleetii meetaabolayitii bishaan sadarkaa LC-MS 75μl (Honeywell) keessatti deebi’ee dhaabbate. Erga seentiriifiigeeshiniin 21,000 g irratti daqiiqaa 5f 4°C irratti, 20 μl supparnaataantii qulqullaa’e xiinxala amiinoo asiidii dhangala’aadhaaf kan oolu yoo ta’u, kan hafe ammoo battalumatti xiinxala aniyaaniif fayyadameera (armaan gaditti ilaali). Xiinxalli amiinoo asiidii pirootokoolii benzoyl chloride derivatization kanaan dura ibsame fayyadamuun raawwatame (55, 56). Tarkaanfii jalqabaa irratti, soodiyeem kaarbooneetii 100 mM (Sigma-Aldrich) 10μl meetaabolayitii baafame 20μl keessatti dabalamee, sana booda 10μl 2% beenzoyl chloride (Sigma-Aldrich) sadarkaa LC ACN keessatti dabalameera. Saamuda yeroo gabaabaaf vortexed ta’ee booda 21,000 g irratti daqiiqaa 5f 20°C irratti seentirifuugii taasifamee jira. Supernatant qulqullaa’e gara 2 ml autosampler vial kan conical glass insert (200 μl volume) qabutti dabarsuu. Saamudaaleen kan xiinxalaman sirna LC ga’umsa olaanaa qabu Acquity iClass (Waters) kan Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) high-resolution precision mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) waliin walqabate fayyadamuun ture. Xiinxalaaf, saamuda derivatized 2μl gara 100×1.0 mm cimina guddaa silica T3 column (Bishaan) 1.8μm particles of keessaa qabu keessatti lilmoodhaan naqame. Saffisni yaa’aa 100μl/min yoo ta’u, sirni baafaaraa baafaara A (10 mM amooniyeemii foormeetii fi 0.15% asiidii foormiik bishaan keessatti) fi baafaara B (ACN) of keessaa qaba. Giraadiyeentiin akka armaan gadiitti: 0%B daqiiqaa 0 irratti; 0%B. 0 hanga 15% B daqiiqaa 0 hanga 0.1tti; 15 hanga 17% B daqiiqaa 0.1 hanga 0.5tti; B daqiiqaa 0.5 hanga 14tti %17 hanga 55; B daqiiqaa 14 hanga 14.5tti %55 hanga 70; daqiiqaa 18 keessatti 14.5 hanga 70 hanga 100% B irratti; 100% B daqiiqaa 18 hanga 19tti; daqiiqaa 19 hanga 19.1tti 100 hanga 0% B; 0% B daqiiqaa 19.1 hanga 28tti (55, 56). Ispeektiroomeetiriin heddumminaa QE-HF haala ayoonisaayizii pozaatiivii ta’een kan hojjetu yoo ta’u, daangaa ulfaatinaa m/z (reeshiyoo heddumminaa/chaarjii) 50 hanga 750. Murteen hojiirra oole 60,000 yoo ta’u, galmi ayoon to’annoo faayidaa (AGC) argame 3×106 yoo ta’u, yeroon ayoon ol’aanaa milisekondii 100 dha. Maddi ayoonisaayizeeshinii elektiroo biifamuu ho’aa (ESI) voolteejii biifamuu 3.5 kV, teempireechara kaappilaarii 250°C, dhangala’aa qilleensaa qoloo 60 AU (yunitii fedhii malee), fi dhangala’aa qilleensaa gargaaraa 20 AU ta’een hojjeta. 250°C ta’a. Leensiin S 60 AU irratti kan saagamedha.
Xiinxala aniyoon kiroomaatoogiraafii-MS asiidota orgaanikii 13Cn mallatteeffame. Rooba meetaabolayitii hafe (55μl) sirna Dionex ion chromatography (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) kan QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) waliin walqabate fayyadamuun xiinxalameera. Gabaabumatti, 5μl meetaabolayitii baafame tarree Dionex IonPac AS11-HC HPLC (2 mm×250 mm, guddina paartiikilii 4μm, Thermo Fisher Scientific)n hidhamee haala dhiibuu-in gartokkee loop reeshiyoo guutinsaa 1. ) Dionex IonPac AG11-HC tarree eegduu (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Saayinsii). Teempireecharri tarree 30°C irratti kan eegamu yoo ta’u, autosampler ammoo 6°C irratti kan saagamudha. Karaa jenereetarii eluent giraadiyeentii pootaasiyeem haayidirooksaayidii maddisiisuudhaaf kaartuujjii pootaasiyeem haayidirooksaayidii bishaan ayoonisaayid ta’een kenname fayyadamuu. Meetaabolayitoota saffisa yaa’aa 380μl/min addaan baasuu, garagalcha armaan gadii hojiirra oolchuudhaan: daqiiqaa 0 hanga 3, 10 mM KOH; Daqiiqaa 3 hanga 12, KOH 10 hanga 50 mM; Daqiiqaa 12 hanga 19, KOH 50 hanga 100 mM; Daqiiqaa 19 hanga 21 , 100 mM KOH; Daqiiqaa 21 hanga 21.5, KOH 100 hanga 10 mM. Tarreen kun daqiiqaa 8.5f KOH 10 mM jalatti irra deebi’amee madaalame.
Meetaabolayitoonni dhiqaman tarree booda yaa’a dabalataa isopropanol 150μl/min waliin walitti makamuun gara ispeektiroomeetirii baay’ee furmaata olaanaa qabuu fi haala ayoonisaayizeeshinii negaatiivii ta’een hojjetutti qajeelfamu. MSn m/z 50 hanga 750tti ulfaatina 60,000 ta’een hordofaa jira. AGCn 1×106 irratti kan saagame yoo ta’u, yeroon ayoon guddaan 100 ms irratti eegama. Maddi ESI ho’ifame kun voolteejii biifamuu 3.5 kV ta’een hojjetameera. Sajoo biroo madda ayoon akka armaan gadiitti: teempireechara kaappilaarii 275°C; dhangala’aa gaazii qoloo, 60 AU; dhangala’aa gaazii gargaaraa, 20 AU 300°C irratti, fi S leensii gara 60 AUtti saaguu.
Xiinxala odeeffannoo meetaabolayitoota 13C mallatteeffame. Xiinxala daataa reeshiyoo isotooppiitiif sooftiweeri TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) fayyadamuu. Eenyummaan kompaawundii tokkoon tokkoo kompaawundii wabii amanamaa ta’een mirkanaa’ee of danda’ee xiinxalameera. Xiinxala badhaadhina isotooppii raawwachuuf, bal’inni kiroomaatoogiraamii ayoon baafame (XIC) tokkoon tokkoon isotooppii 13C (Mn) [M + H] + irraa kan baafame yoo ta’u, n lakkoofsa kaarboonii kompaawundii galma ta’ee, amiinoo asiidota xiinxaluuf kan oolu yookiin [ MH] + aniyaanota xiinxaluuf kan ooludha. Sirrummaa heddumminaa XIC miliyoona tokkotti kutaa shan gadi yoo ta’u, sirrummaan RT daqiiqaa 0.05 dha. Xiinxalli badhaadhina kan raawwatamu reeshiyoo tokkoon tokkoon isotooppii argamee fi walitti qabama isotooppii hunda kompaawundii walgitu shallaguudhaani. Reeshiyoon kunniin tokkoon tokkoon isotooppiitiif akka gatii dhibbeentaatti kan kennaman yoo ta’u, bu’aan isaas akka kanaan dura ibsametti badhaadhina dhibbeentaa moolaarii (MPE) tti ibsama (42).
Peeleetii niwuroonii qabbanaa’e meetaanoolii %80 (v/v) qorraa akka cabbii (ice-cold) keessatti homogenized, vortexed, fi -20°C irratti daqiiqaa 30f incubatted. Saamuda ammas vortex gochuun +4°C irratti daqiiqaa 30f sochoosaa. Saamuda 21,000 g irratti daqiiqaa 5f 4°C irratti seentirifuugii taasifamee, sana booda supparnaataantiin argame walitti qabamee xiinxala itti aanuuf 25°C irratti konsentreetara SpeedVac fayyadamuun gogfame. Akkuma armaan olitti ibsame, xiinxalli LC-MS amiinoo asiidota seelii sassaabaman irratti raawwatameera. TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) fayyadamuun xiinxalli daataa ulfaatina monoisotopic kompaawundii tokkoon tokkoo fayyadamuun raawwatameera. Kuwantile normalization daataa meetaabolayitii paakeejii sooftiweerii preprocessCore fayyadamuun raawwatameera (57).
Qophii cilee. Hantuutni dafee kaarboon daayi’oksaayidiin anesthetized ta’ee mataa irraa murame, sammuu dafee mataa irraa baafame, akkasumas cirracha raafama bubbeedhaan guutame (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) fayyadamuun kutaa sagittal 300 hanga 375 μm ta’etti murame Cold carbon gasification (95% O2 and 5% CO2) Low Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM soodiyeem fosfeetii baafaara, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-gilukoosii, 1.0 mM CaCl2 fi 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 fi 310 hanga 330 mOsm tti sirreessuu). Cileewwan sammuu argaman gara golee Ca2 + ACSF ol’aanaa (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM soodiyeem fosfeetii baafaara, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-gilukoosii, 4.0 mM CaCl2 fi mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 fi 310 hanga 320 mOsm) ta’a. Slices daqiiqaa 20 hanga 30tti kuusuu, akka isaan waraabuu dura deebi'uu danda'aniif.
waraabuu. Waltajjiin maaykirooskooppii golee waraabbii dhaabbataa fi leensii kaayyoo bishaan keessa cuuphamuu 20x (Scientifica) qabu waraabbii hundaaf fayyadameera. Seelonni Purkinje tilmaamaman (i) guddina qaamaa, (ii) bakka anatoomii sammuu, fi (iii) ibsa jiinii rippoortara mtYFP fluorescent tiin adda baafamaniiru. Piipettiin paach kan mormii fiixee meegoomii 5 hanga 11 qabu kaappilaarii gilaasii boroosilikeetii (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Germany) fi piipettii horizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA) tiin baafama. Warraaqsi hundi kan raawwatame ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany), kan sooftiweeri Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) tiin to’atame. Yaalii kana saffisa saamuda fudhachuu 12.5 kHz tiin galmaa’eera. Mallattoon kun filtara Bessel darbiinsa gabaabaa lama kan firikuweensii kutaa 1.3 fi 10 kHz ta’een calalama. Kapaasitaansii meembraanii fi piipeetichaa sarkiyuutii beenyaa amplifaayira fayyadamuun beenyaa ta’a. Yaalii hunduu to’annoo kaameraa Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Germany) jalatti kan raawwatame yoo ta’u, kunis sooftiweeri Hokawo (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany) tiin kan to’atame ture.
Qindaa’ina fi xiinxala seelii guutuu idilee. Galmeessuun dura battaluma sanatti, furmaata keessoo wantoota armaan gadii of keessaa qabuun piipettii guutuu: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM pootaasiyeem gilukoneetii, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) fi 10.0 mM kiriiyaatiniinii fosfeetii gara pH 7.25tti kan sirreeffame yoo ta’u, dhiibbaan osmootikii 290 mOsm (sukroosii) ture. Humni 0 pA ta’e erga dibamee booda battaluma sanatti pooteenshaalli meembraanii boqonnaa safarame. Mormiin galtee kan safaramu kaarentii haayperpoolaarizeeshinii -40, -30, -20, fi -10 pA hojiirra oolchuudhaani. Guddina deebii voolteejii safaruu fi seera Ohm fayyadamuun mormii galtee shallagi. Sochiin ofumaan raawwatamu daqiiqaa 5f voolteejii kilaampii keessatti galmaa’ee, sPSCn immoo iskiriiptii beekamtii walakkaa otomaatikiin fayyadamuun Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) keessatti adda baafamee safarameera. Kaarviin IV fi kaarentiin haala tasgabbaa’aa baatirii pooteenshaalota adda addaa irratti (-110 mV irraa eegalee) qabachuu fi voolteejii tarkaanfii 5 mVn dabaluudhaan safarama. Omishni AP kaarentii depolarizing fayyadamuun qoratameera. Seelii -70 mV irratti osoo paalsii kaarentii depoolaariziingii hojiirra oolchituu qabadhu. Guddina tarkaanfii tokkoon tokkoon yuunitii waraabbii addaan sirreessaa (10 hanga 60 pA). Harkaan ispiikeewwan pulsii kanneen firikuweensii AP ol’aanaa fidan lakkaa’uudhaan firikuweensii AP ol’aanaa shallagi. Ulaagaa AP kan xiinxalamu bu’aa lammaffaa pulsii depoolaarizeeshinii kan jalqaba AP tokko yookiin isaa ol kakaasu fayyadamuun.
Qindaa’ina fi xiinxala paach bocame. Pirootokoolota istaandaardii fayyadamuun galmee paach bocame raawwadhu. Piipeettii ATP fi GTP irraa bilisa ta’e kan wantoota armaan gadii hin qabne fayyadamuu: 128 mM gilukoneetii K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA fi 2 mM MgCl2, fi pH 7.2tti sirreessuu (KOH fayyadamuun). ATP fi GTP furmaata seelii keessaa irraa kan hafe yoo ta’u, kunis ce’umsa hin to’atamne meembraanii seelii ittisuuf. Piipeetiin paach galmee paach punched argachuuf furmaata keessoo ammphotericin of keessaa qabuun (tilmaamaan 200 hanga 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) guutama. Amfooteriisiin daayimeetiil salfoksaayidii keessatti bulbulame (xiyyeeffannoo dhumaa: 0.1 hanga 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Xiyyeeffannaan DMSO fayyadame niwuroonota qorataman irratti dhiibbaa guddaa hin qabu ture. Adeemsa punching keessatti, mormiin chaanaalii (Ra) walitti fufiinsaan hordofamee, yaalii erga ampiliituudii Ra fi AP tasgabbaa’ee booda (daqiiqaa 20-40) jalqabame. Sochiin ofumaan uumamu daqiiqaa 2 hanga 5tti kilaampii voolteejii fi/ykn kaarentii keessatti safarama. Xiinxalli odeeffannoo kan raawwatame Igor Pro (version 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (version 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) fi GraphPad Prism (version 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) fayyadamuun ture. Ameerikaa). AP ofumaan uumamu adda baasuuf, IgorPro's NeuroMatic v3.0c plug-in fayyadama. Ulaagaa kenname fayyadamuun APwwan ofumaan adda baasuu, kunis galmee tokkoon tokkoo isaaniitiif dhuunfaan sirreeffama. Giddugaleessa ispeekii fayyadamuun, firikuweensii ispeekii firikuweensii ispeekii battalaa guddaa fi firikuweensii ispeekii giddugaleessaa waliin murteessii.
PN adda baafamuu. Pirootokoolii kanaan dura maxxanfamee wajjin walmadaaluudhaan, PNs sadarkaa murtaa'e irratti sammuu hantuutaa irraa qulqullaa'e ( 58 ). Gabaabumatti, cerebellum addaan cicciramee fi meeshaa addaan baasu qorraa akka cabbii [HBSS Ca2+ fi Mg2+ malee, 20 mM gilukoosii, penicillin (50 U/ml) fi streptomycin (0.05 mg/ ml) dabalamee], achiis meediyaa paapaayinii keessatti daakuun [HBSS, 1-cysteine·HCl dabalame (1 mg / ml), papain (16 U / ml) fi deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Daqiiqaa 30f 30°C irratti wal’aanuu. Jalqaba tishuuwwan meeshaa HBSS dafqa hanqaaquu (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) fi DNase (0.1 mg/ml) of keessaa qabu keessatti ho’a kutaa keessatti dhiqachuun akka bullaa’insa inzaayimii ittisuuf, achiis meeshaa HBSS gilukoosii 20 mM of keessaa qabu keessatti suuta suutaan HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) fi DNase (0.1 mg/ml) seelii tokko qofa gadhiisa. Bu’aan seelii suspension karaa 70μm cell strainer calalame, sana booda seelonni seentiriifiigeeshiniin (1110 rpm, daqiiqaa 5, 4°C) pelleted fi deebi’ee meeshaa sassaabuu [HBSS, 20 mM glucose, 20% fetal bovine ) Seerum, penicillin (50 U/ml) fi streptomycin dabalame keessatti suspended (0.05 mg/ml)]; jiraachuu seelii piroopiidiyaam ayoodaayidii waliin madaaluu fi dhangala’aa seelii gara 1×106 hanga 2×106 seelii/ml sirreessuu. Flow cytometry dura, suspension karaa 50 μm cell strainer calalame.
Saayitoomeetira yaa’aa. Seelii sassaabuun maashinii FACSAria III (BD Biosciences) fi sooftiweeri FACSDiva (BD Biosciences, version 8.0.1) fayyadamuun 4°C irratti raawwatameera. Suspension seelii dhiibbaa 20 psi jalatti nozzle 100 μm fayyadamuun saffisa ~2800 events/sec tiin sassaabame. Ulaagaaleen gating aadaa (guddina seelii, loogii baaymoodaalii, fi amala faca’iinsaa) PN gosoota seelii biroo irraa adda baafamuu sirrii mirkaneessuu waan hin dandeenyeef, tooftaa gating kallattiin walbira qabamuu cimina YFP fi autofluorescence mitoYFP+ ​​fi to’annoo mitoYFP − Hantuuta keessatti hundaa’uun kaa’ama. YFPn saamuda sarara laayizerii 488 nm tiin kan kakaasu yoo ta’u, mallattoon kunis filtara dabarsoo baandii 530/30 nm fayyadamuun kan adda baafamudha. Hantuuta mitoYFP+ ​​keessattis ciminni walqabataa jiini rippoortara Rosa26-mitoYFP qaama niwuroonii fi ciccitaa aksoonii adda baasuuf fayyadama. 7-AAD laayizerii keelloo 561 nm tiin kan kakaafamu yoo ta’u, seelii du’e hambisuuf filtara baandii 675/20 nm tiin adda baafama. Yeroo walfakkaatutti astrocytes adda baasuuf, seelii suspension ACSA-2-APCn faalamee, sana booda saamuda sarara laayizerii 640 nm tiin irradiated, fi 660/20 nm bandpass filter mallattoo adda baasuuf fayyadame.
Seelonni walitti qabaman seentiriifiigeeshiniin (1110 rpm, daqiiqaa 5, 4°C) peeleetii ta’anii hanga itti fayyadamanitti -80°C irratti kuufamaniiru. Hantuutni Mfn2cKO fi ilmoolee balfa isaanii jijjiirama adeemsaa xiqqeessuuf guyyaa tokkotti ramadamu. Dhiyeessii fi xiinxalli daataa FACS sooftiweeri FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) fayyadamuun raawwatameera.
Akkuma armaan olitti ibsame (59), yeroo dhugaa PCR niwuroonota sassaabaman irraa DNA adda baasuun mtDNA quantification itti aanuuf fayyadama. Linearity fi threshold sensitivity jalqaba irratti qPCR lakkoofsa seelii adda addaa irratti fiiguun qoratameera. Gabaabumatti, 300 PN baafaara lysis 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 fi proteinase K (200 ng/ml) of keessaa qabu keessatti walitti qabuun 55°C irratti daqiiqaa 120f inkuubeer gochuu. Seelonni dabalataan daqiiqaa 10f 95°C irratti inkuubeer ta’uun pirootiinii K guutummaatti akka hin sochoone mirkaneessuuf qorannoo TaqMan (Thermo Fisher) mt-Nd1 adda ta’e fayyadamuun mtDNA sirna 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific) keessatti semi-quantitative PCRn safarameera. Saayinsii, lakkoofsa kataloogii Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, lakkoofsa kataloogii AIVI3E8) fi 18S (Thermo Fisher Scientific, lakkoofsa kataloogii Hs99999901_s1) jiiniiwwan.
Qophii saamuda pirootiyoomii. Furmaata 95 ° C irratti daqiiqaa 10f ho'isuu fi sonicating, lysis buffer keessatti [6 M guanidine chloride, 10 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide fi 100 mM tris- Lyse frozen neuron pellets HCl keessatti]. Bioruptor (Diagenode) irratti daqiiqaa 10f (sekondii 30 pulse / sekondii 30 pause period). Saamuda 20 mM tris-HCl (pH 8.0) keessatti 1:10 diluted, 300 ng trypsin gold (Promega) waliin makamee, fi halkan guutuu 37°C irratti inkuubeer ta’ee guutummaatti bullaa’uu galmaan ga’e. Guyyaa lammaffaa saamuda 20,000 g irratti daqiiqaa 20f seentirifuugii taasifamee ture. Suppernataantiin asiidii foormiik %0.1n kan diilalla’e yoo ta’u, furmaanni isaas StageTips ofumaan hojjetameen soogidda irraa baafame. Saamuda meeshaa SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) keessatti 45°C irratti gogfame, sana booda peeptiidichi asiidii foormiik %0.1 keessatti dhaabbate. Saamuda hunduu yeroo tokkotti nama tokkoon qophaa’eera. Saamuda astiroosaayitii xiinxaluuf, peeptiidonni soogidda irraa bilisa ta’an 4 μg tandem mass tag (TMT10plex, lakkoofsa kataloogii 90110, Thermo Fisher Scientific) reeshiyoo peeptiidii fi TMT ri’ajantii 1:20 ta’een mallatteeffamaniiru. Asxaa TMT tiif, 0.8 mg TMT ri’ajantiin ACN bishaan hin qabne 70 μl keessatti deebi’ee kan dhaabbate yoo ta’u, peeptiidiin goge gara 9 μl 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate) tti deebi’ee kan ijaarame yoo ta’u, kana irratti 7 μl TMT ri’ajantiin ACN keessatti itti dabalame. Xiyyeeffannaan %43.75 ture. Daqiiqaa 60 booda walnyaatinsi sun 2 μl 5% hydroxylamine tiin dhaamfame. Peeptiidonni mallatteeffaman walitti qabamaniiru, gogfamaniiru, asiidii foormiik %0.1 (FA) 200μl keessatti deebi’anii dhaabbachuun, lamatti qoodamanii, sana booda StageTips ofumaan hojjetaman fayyadamuun soogidda irraa bilisa ta’aniiru. UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) fayyadamuun, walakkaa lamaan keessaa tokko 1mm x 150mm Acquity chromatographic column kan 130Å1.7μm C18 particles (Waters, catalog No. SKU: 186006935) guutame irratti fractionated ta’e. Thermo Fisher Saayinsii). Peeptiidota saffisa yaa’aa 30μl/min addaan baasuu, daqiiqaa 85f baafaara B %1 irraa hanga %50tti daqiiqaa 96f tarkaanfii tarkaanfiin garagalchuu, daqiiqaa 3f baafaara B %50 irraa hanga %95tti, sana booda baafaara B %95f daqiiqaa 8; Baafarri A %5 ACN fi 10 mM ammooniyeemii baay’ee kaarbooneetii (ABC) yoo ta’u, baafarri B ammoo %80 ACN fi 10 mM ABC dha. Daqiiqaa 3tti firaakshinoota walitti qabuun garee lamatti (1 + 17, 2 + 18 fi kkf) walitti makuun vaakiyuumii seentiriifiyuujii keessatti gogsi.
Xiinxala LC-MS/MS. Ispeektiroomeetirii baay’eedhaaf, peeptiidonni (lakkoofsi r119.aq) tarree xiinxala PicoFrit 25 cm, daayameetira keessaa 75 μm (leensii kaayyoo haaraa, lakkoofsa kutaa PF7508250) kan 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat) qabu irratti adda baafamaniiru, EASY-nLC fayyadamaa 1200 (Thermo Fisher Saayinsii, Jarmanii). Utubaa 50°C irratti eegamee ture. Baafaroota A fi B bishaan keessatti asiidii foormiik %0.1 fi ACN %80 keessatti asiidii foormiik %0.1 dha. Peeptiidonni baafaara B %6 hanga %31 daqiiqaa 65f, baafaara B %31 hanga %50 daqiiqaa 5f garagalcha 200 nl/min adda baafamaniiru. Peeptiidonni dhiqaman ispeektiroomeetira maassii Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific) irratti xiinxalamaniiru. Safartuun dursaa peeptiidii m/z kan raawwatamu murtee 120,000 kan ta’e 350 hanga 1500 m/z gidduutti. Anniisaa walitti bu’iinsaa %27 normalized fayyadamuun, dursaan cimaan haala chaarjii 2 hanga 6 qabu anniisaa olaanaa C trap dissociation (HCD) cleavage tiif filatama. Yeroon marsaa 1 s tti saagama. Gatiin m/z ciccitaa peeptiidii kiyyoo ayoon keessatti galma AGC isa xiqqaa 5×104 fi yeroon lilmoo guddaa 86 ms fayyadamuun safarameera. Erga ciccitamanii booda, dursaan tarree daayinamikii ala ta’e irratti s 45f kaa’ame. Peeptiidonni TMTn mallatteeffaman tarree Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, lakkoofsa kataloogii 164942) irratti adda baafamaniiru, ispeektaroonni godaansaa ammoo ispeektiroomeetira baay’ina Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) meeshaalee ayoonota bifa dalgee dirree ol’aanaa asiimeetrikii (FAIMS) qaban irratti xiinxalamaniiru (Thermo Fisher Scientific) voolteejii beenyaa lama −50 fi −70 V irratti hojjeta.MS3 dursaa walsimsiisaa irratti hundaa’uun filatame safartuu mallattoo ayoon gabaasa TMT tiif fayyadama. Addaan bahuun peeptiidii EASY-nLC 1200 irratti, 90% linear gradient elution fayyadamuun, buffer concentration 6% hanga 31% waliin raawwatame; baafaar A 0.1% FA, fi baafarri B 0.1% FA fi 80% ACN ture. Tarreen xiinxala 50°C irratti hojjeta. Faayilii jalqabaa akkaataa voolteejii beenyaa FAIMS tiin qooduuf FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) fayyadami.
Pirootiinii adda baasuu fi baay’isuu. Motora barbaacha Andromeda walitti makame fayyadamuun, daataa jalqabaa MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) fayyadamuun xiinxalameera. Tartiiba Cre recombinase fi YFP Aequorea victoria irraa argame malees, ispeektaroonni ciccitaa peeptiidii tartiiba kanoonii fi tartiiba isoform pirootiyoomii wabii hantuutaa (Proteome ID UP000000589, UniProt irraa Caamsaa 2017 buufame) barbaadameera. Oksaayidii meetiyooniinii fi aseetiileeshiniin pirootiinii N-tarminaalii akka fooyya’iinsa jijjiiramaatti kaa’ameera; siistaayinii kaarbaamooyil meetilaayishiniin akka fooyya’iinsa dhaabbataatti kaa’ameera. Paaraameetotni bullaa’insa nyaataa “specificity” fi “trypsin/P” tti saagamu. Lakkoofsi peeptiidii fi peeptiidota raazar pirootiinii adda baasuuf itti fayyadaman xiqqaan 1 dha; lakkoofsi xiqqaan peeptiidota addaa 0. Haala walsimsiisa kaartaa peeptiidii jalatti, saffisi adda baasuu pirootiinii 0.01 ture. Filannoon “Second Peptide” jedhu dandeessifameera. Faayilota jalqabaa adda addaa gidduutti adda baasuu milkaa’aa dabarsuudhaaf filannoo “fiigicha gidduutti walsimsiisu” fayyadami. Lakkoofsa reeshiyoo xiqqaa LFQ 1 fayyadamuun lakkoofsa asxaa irraa bilisa ta’e (LFQ) (60). Ciminni LFQ yoo xiqqaate gatiiwwan sirrii lamaaf yoo xiqqaate garee jeenootaayipii tokko keessatti yeroo tokkoon tokkoon isaaniitti calalama, fi raabsa idilee bal’ina . 0.3 fi gadi bu’uu 1.8. Bu’aa LFQ xiinxaluuf waltajjii shallaggii Perseus (https://maxquant.net/perseus/) fi R (https://r-project.org/) fayyadamuu. Xiinxala ibsa adda addaatiif qorannoon t karaa lamaa giddu galeessa paakeejii sooftiweerii limmaa irraa argame fayyadameera (61). Xiinxalli daataa qorannoo ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally fi pheatmap fayyadamuun raawwatama. Daataan pirootiyoomiksii TMT irratti hundaa’e MaxQuant version 1.6.10.43 fayyadamuun xiinxalameera. Search for raw proteomics data from UniProt's human proteomics database, which was downloaded in September 2018. Xiinxalli kun sababa sirreeffama qulqullina isotooppii oomishtoonni dhiyeessan of keessatti qabata. Xiinxala ibsa adda addaatiif R keessatti limma fayyadami. Deetaan jalqabaa, bu'aan barbaacha kuusdeetaa, fi adeemsa hojii xiinxala deetaa fi bu'aan hundi isaanii karaa kuusaa michuu PRIDE adda baastuu tuuta deetaa PXD019690 waliin gamtaa ProteomeXchange keessatti kuufamaniiru.
Yaadannoowwan dalagaa xiinxala badhaadhessa. Meeshaan Xiinxala Daandii Ogummaa (QIAGEN) badhaadhina jechoota yaadannoo dalagaa tuuta deetaa torban 8 irratti murteessuuf fayyadameera (Fakkii 1). Gabaabumatti, tarreen pirootiinii baay’inaan xiinxala daataa LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) irraa argame ulaagaalee calaqqee armaan gadii waliin fayyadama: Mus musculus akka gosaa fi duubbeetti kan filatame yoo ta’u, gosti gatii P Benjaminiin badhaadhina 0.05 fi isaa gadi ta’eef sirreeffame agarsiisa. Giraaphii kanaaf, tokkoon tokkoon kilaastara keessatti gosootni dabalataa shanan ol’aanoo gatii P sirreeffame irratti hundaa’uun agarsiifamu. Qormaata t dachaa fayyadamuun, sagantaa guddina sarara sadarkaa lamaa Benjamini, Krieger, fi Yekutieli (Q = 5%) fayyadamuun, xiinxalli ibsa pirootiinii yeroo-koorsii kaadhimamaa barbaachisoo gosa tokkoon tokkoon keessatti adda baafaman irratti raawwatama, tarreen tokkoon tokkoon isaas addaan xiinxalama. SD walfakkaatu fudhachuun hin barbaachisu.
Bu’aa qorannoo kanaa kuusaawwan deetaa maxxanfaman waliin walbira qabuu fi fakkii 1 irratti diyaagiraamii Venn maddisiisuudhaaf, tarree pirootiinii baay’inaan MitoCarta 2.0 annotations (24) waliin walitti qabne. Diyaagiraamii uumuuf meeshaa toora interneetii Diyaagirama Veen kaasi (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) fayyadami.
Odeeffannoo bal’aa hojimaata istaatiksii xiinxala pirootiyoomiksiitiif oolu ilaalchisee, maaloo kutaa walgitu Meeshaalee fi Mala ilaali. Yaalii biroo hundaaf odeeffannoon bal’aan sheekkoo walgitu keessatti argamuu danda’a. Yoo haala biraatiin ibsame malee, daataa hunduu akka giddugaleessa ± SEM tti kan ibsamu yoo ta’u, xiinxalli istaatiksii hundi sooftiweeri GraphPad Prism 8.1.2 fayyadamuun raawwatameera.
Barreeffama kanaaf meeshaalee dabalataa argachuuf, maaloo http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 ilaalaa
Kun barruu banaa ta’ee fi haala hayyama Creative Commons Attribution-Non-Commercial License jalatti raabsame yoo ta’u, kunis itti fayyadamni dhumaa bu’aa daldalaaf kan hin taanee fi yaadni isaa hojiin jalqabaa sirrii ta’uu isaa hanga ta’etti, meeshaa kamiinuu itti fayyadamuu, raabsuu fi baay’isuu kan hayyamu dha. Wabeeffannaa.
Hubachiisa: Namni ati fuula sanaaf gorsitu email sana akka argu akka barbaadduu fi spam akka hin taane akka beekuuf qofa teessoo email kee akka kennitu qofa si gaafanna. Teessoo email kamiyyuu hin qabannu.
Gaaffiin kun daawwataa ta'uu kee qorachuu fi ofumaan spam akka hin dhiyaanne ittisuuf kan gargaarudha.
E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Laarsan
Xiinxalli pirootiyoomiksii niwuroonota hojii dhabeeyyii ta’an sagantaaleen meetaabolii niwuroodegenereeshinii ofirraa ittisuuf akka socho’an mul’ise.
E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Laarsan
Xiinxalli pirootiyoomiksii niwuroonota hojii dhabeeyyii ta’an sagantaaleen meetaabolii niwuroodegenereeshinii ofirraa ittisuuf akka socho’an mul’ise.
©2020 Waldaa Guddina Saayinsii Ameerikaa. mirgi hunduu kan eegamedha. AAAS michuu HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef fi COUNTER ti. Guddina Saayinsii ISSN 2375-2548.