Yeroo ammaa†Teessoo ammaa: OX11 0DE, UK, Gamoo Daayimandii, Paarkii Saayinsii fi Kalaqaa Harwell, Dietcote, Oxfordshire, UK, Madda Ifa Daayimandii Koo., Ltd., Giddugala Suuraa Baayoloojii Elektirooniksii.
Kompileeksiin ifa sassaabuu wiirtuu walnyaatinsaa 1 (RC-LH1) qaama footosinteetikii ijoo baakteeriyaa foototroofii diimaa ti. Caasaa maaykirooskoopii cryo-elektiroonii lama kompileeksii RC-LH1 Rhodopseudomonas palustris irraa galchine. Caasaan furmaata 2.65-Å kompileeksii RC-LH114-W loopoota subunitii LH1 14 kan RC marsee jiru kan of keessaa qabu yoo ta’u, kunis pirootiinii Wn kan addaan cite yoo ta’u, kompileeksii pirootiinii-W hin qabne ammoo guutummaatti walnyaatinsa RC RCn marfameedha. Cufame 16 subunit LH1 loop. Walbira qabamuun caasaa kanaa, jijjiirama konfoormeeshinii kanaan dura hin murtoofne yeroo kinooniin bakka RC QBtti hidhu dabalatee, akkasumas bakka iddoowwan hidhuu kinoonii gargaaraa, kanneen gara RCtti Darbuuf gargaaran dabalatee, daayinamiksii kiniinii kompileeksii RC-LH1 keessatti hubannoo kenna. Caasaan addaa pirootiinii W cufamuu loop LH1 dhorka, kanaanis jijjiirraa kinoonii/kiinooloonii saffisiisuuf chaanaalii uuma.
Anniisaa footosinteesiin argamu lubbu qabeeyyii lafarra jiran hunda jechuun ni dandaʼama, akkasumas baayooteknooloojii aduutiif carraa guddaa qaba. Baakteeriyaan foototiroofiik diimaan footosinteesii addunyaa kan jajjabeessan yoo ta’u, haala anniisaa fi dandeettii meetaabolii adda addaas agarsiisu. Isaanis footosinteesii irraa fagaachuu fi dukkana keessatti akka baakteeriyaa heterotrophic guddachuu danda’u, naayitiroojiinii fi kaarboon daayi’oksaayidii sirreessuu, haayidiroojiinii uumuu fi kompaawundoota urgooftuu mancaasu danda’u (1-3). Adeemsa kanaaf anniisaa kennuudhaaf ifa saffisaa fi gahumsaan gara anniisaa keemikaalaatti jijjiiramuu qaba. Adeemsi kun kan jalqabu yeroo kompileeksii anteenaa ifa kiyyootti galchu ifa xuuxee anniisaa qabame gara wiirtuu walnyaatinsaa (RC)tti dabarsudha, kanaanis addaan bahuu chaarjii jalqaba (4 – 7). Yuunitiin bu’uuraa footosinteesii baakteeriyaa foototroofii diimaa keessatti gosa 2 RC irraa kan ijaarame yoo ta’u, kompileeksii ifa sassaabuu 1 (LH1) tiin kan marfame yoo ta’u, kompileeksii wiirtuu RC-LH1 uuma. LH1 kan uumamu tarree heeteroodaayimaroota αβ qaxxaamuroo ta’aniin yoo ta’u, tokkoon tokkoon isaanii molakiyuulota kiloorofiilii baakteeriyaa lamaa (BChl) a fi karootinooyidii tokko ykn lama hidhu (8-12). Anteenaan LH1 inni salphaan αβ heterodimers 16 ykn 17 kan RC (9-13) marsanii loop cufame keessatti of keessaa qaba, garuu kompileeksoota ijoo biroo keessatti, peeptiidonni transmembrane itti fufiinsa LH1 naannoo jiru addaan kutu , Kanaanis tamsa'ina quinol/quinone RC fi cytochrome bc1 complex gidduutti guddisa (11, 13-15 irratti kan argamu). Biqiltuun foototroofii diimaa Roodopseudomonas (Rps.) jedhamu orgaanizimii moodeela ta’ee fi dabarsoo anniisaa fi elektiroonii footosinteesii deeggaru hubachuu danda’uudha. Caasaan kiristaala jalqabaa Rps. Moodeelli kompileeksii palustris RC-LH1 RC yoo ta’u, loopoota heterodimeric LH1 15n kan marfame yoo ta’u, isaanis pirootiinii hin beekamne “Protein W” (14) jedhamuun addaan citu. Pirootiinii-W booda RPA4402 jedhamee adda baafame, kunis pirootiinii 10.5kDa amala hin qabnee fi sadii kan tilmaamame transmembrane helices (TMH) qabu (16). Nu rpa4402 jiini pirootiinii W koodii godhu maqaa moggaasa jiiniiwwan RC-L, M (pufL, pufM) fi LH1α, β (pufA, pufB) subunits koodii godhaniif fayyadaman waliin akka walsimuuf maqaa jijjiiruuf yaada dhiheessina. Kan nama ajaa’ibu pirootiiniin-W RC-LH1 gara %10 qofa keessatti argama, kunis Rps mul’isa. palustris kompileeksoota RC-LH1 adda addaa lama oomisha. Asitti, caasaa cryo-EM (cryo-EM) furmaata olaanaa kompileeksoota hundee lamaa, tokko pirootiinii W fi 14 αβ heterodimers, inni kaan pirootiinii W malee fi cufame 16 Heterodimer LH1 loop gabaasna. Caasaan keenya hubannoo kompileeksii RC-LH1 Rps keessatti jijjiirama tarkaanfii bakka bu’a. palustris, sababni isaas nuti uummata walfakkaataa tokkoon tokkoon garaagarummaa xiinxallee fi tokkoon tokkoon peeptiidii fi pigmentii hidhamee fi lipiidotaa fi kinoonii walqabatan ifatti ramaduuf murtoo gahaa qabna. Walbira qabamee yoo ilaalamu caasaalee kanaa pirootinoonni TMH-W sadan hanga ammaatti kompileeksii RC-LH1 biroo kamiyyuu keessatti hin argamne jijjiirraa kinoonii/kiinooloonii saffisiisuuf chaanaalii kinoonii maddisiisuu isaanii agarsiisa. Lakkoofsi iddoowwan hidhuu lipidii fi kiniinii eegamanii adda baafamaniiru, akkasumas jijjiirama konfoormeeshinii haaraa erga walnyaatinsa kinoonii fi RC booda mul'isneerra, kunis sirna footosiisteemii II (PSII) RC orgaanizimoota foototroofii oksijiinii qabaniif mijachuu danda'a. Argannoon keenya sochii hidhuu fi waljijjiirraa kinetiksii kuinoonii/kiinooloonii RC-LH1 core complex baakteeriyaa phototrophic diimaa keessatti hubannoo haaraa kenna.
Qorannoon bal’aa kompileeksoota lamaan Rps. palustris, tokkoon tokkoon RC-LH1 mala baayookeemikaalaan adda baasna. Kompileeksii pirootiinii W hanqina qabu (kana booda ΔpufW jedhamee kan waamamu) gosa jiini pufW hin qabne irraa qulqullaa'e (16), kompileeksii RC-LH1 tokko qofatu oomishamuu danda'a. Kompileeksii pirootiinii W of keessaa qabu gosa tokkoon kan uumamudha. Pirootiiniin W gosa kanaa C-terminus isaa irratti 10x His tag tiin kan fooyya’u yoo ta’u, kanaaf kompileeksii pirootiinii W of keessaa qabu pirootiinii W baay’ee hanqate waliin sibiilaa sochoosuun bu’a qabeessa ta’ee walitti makamuu danda’a. Kompileeksiin bu’a qabeessa ta’ee adda baafameera (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Akkuma fakkii 1 irratti mul’atutti, kompileeksoonni lamaan RC yuunitii xiqqaa sadii (RC-L, RC-M fi RC-H) kan anteenaa LH1n marfame of keessaa qabu. Caasaan 2.80-A kompileeksii pirootiinii-W hin qabne αβ heterodimers 16 agarsiisa, loop LH1 cufame guutummaatti RC marsee uuma, kana booda kompileeksii RC-LH116 jedhamee waama. Caasaan 2.65Å kompileeksii pirootiinii-W of keessaa qabu 14-heterodimer LH1 pirootiinii-Wn addaan cite qaba, kana booda RC-LH114-W jedhamee waama.
(A fi B) Bakka bu’iinsa fuula kompaawundii. (C fi D) Piigmentiiwwan walitti hidhaman uleewwan keessatti ibsaman. (E fi F) Kompileeksoonni fuula saayitoopilaasmii irraa ilaalaman peeptiidota fi subunitoota LH1 kaartuunii keessatti bakka bu’an kan qaban yoo ta’u, qaawwa pirootiinii-W irraa gara sa’aatiitiin lakkoofsifamaniiru [lakkoofsa Rba wajjin kan walsimu. kompileeksii isfeerooyidii (13)]. LH1-α tiif halluun subunitii pirootiinii keelloo dha; LH1-β tiif halluun subunitii pirootiinii halluu diimaa dha; pirootiinii-W tiif pirootiinichi diimaa dha; RC-H tiif, saayinii dha; RC-L tiif ammoo Burtukaana dha; RC-M tiif, maajeentaa. Koofaaktaroota uleedhaan, magariisa molakiyuulota BChl fi BPh a, diimaan karootinooyidii, keelloon ammoo molakiyuulota UQ10 bakka bu’a. (G fi H) Mul’ata guddifame qaawwa pirootiinii-W naannoo walqixa kompileeksii RC-LH114-W (G) fi kompileeksii RC-LH116 (H) keessatti. Koofaaktaroonni bifa guutinsa iddootiin agarsiifamu, kuinooniin cheeleetii ta’e bifa halluu diimaatiin agarsiifama. Qaawwi pirootiinii-W sarara qaxxaamuraa bifa diimaa qabuun (G) keessatti kan calaqqisu yoo ta’u, boolli xixiqqoo bakka kinoon/kinoolooliin gilgaala LH116 irratti babal’atu sarara qaxxaamuraa gurraacha (H) keessatti calaqqifamaniiru.
Fakkiin 1 (A fi B) RC tarree banaa ykn cufame LH1αβ heterodimers tiin marfame agarsiisa, tokkoon tokkoon isaanii BChl lamaa fi carotenoid tokko hidhu (Fakkii 1, C fi D). Qorannoon kanaan duraa akka agarsiisutti Rps kompileeksii LH1 ta’uu isaati. Karaa baayoosintestikii spirulina xanthin keessatti, gosootni kun baay’ina walmakaa karootinooyidii of keessaa qabu (17). Haa ta’u malee, ispiroopirooksaantiin karootinooyidii olaantummaa qabu yoo ta’u, dhangala’aan isaas quubsaa dha. Kanaafuu, iddoowwan hidhaa LH1 hunda irratti ispirooksaantiin moodeela gochuu filanne. Alfaa fi beetaa poliipeeptiidonni TMH tokkicha naannoo alaa meembraanii gabaabaa qaban (Fakkii 1, A, B, E, fi F). Density haftee 17 C-terminus irratti mul’achuu baatus, alpha polypeptide Met1 irraa gara Ala46tti kompileeksoota lamaan keessatti ciccirame. β poliipeeptiidiin RC-LH116 keessatti Gly4 irraa gara Tyr52tti, RC-LH114-W keessatti ammoo Ser5 irraa gara Tyr52tti hir’ateera. Density 3 ykn 4 N-terminal ykn 13 C-terminal haftee hin mul’anne (Fakkii S1). Xiinxalli ispeektiroomeetirii baay’ee kompileeksii makaa RC-LH1 gosa gosa bosona irraa qophaa’e naannoon dhabame bu’aa heterologous cleavage peeptiidota kanaa ta’uu agarsiise (Fakkii S1 fi S2). N-terminal formylation α-Met1 akkasumas mul'ateera (f). Xiinxalli kun akka agarsiisutti α-peeptiidiin haftee fMet1 hanga Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 kan of keessaa qabu yoo ta’u, β-peeptiidiin ammoo haftee Ser2 hanga Ala53 kan of keessaa qabu yoo ta’u, kunis kaartaa dhangala’aa EM ho’a gadi aanaa wajjin waliigaltee gaarii qaba.
Qindoominni α-His29 fi β-His36 BChls fuula fuulatti taasisa; tokkoon tokkoon αβ heterodimer ollaa isaa waliin walitti qabamee naannoo RC The exciton coupled pigment array (Fakkii 1, C fi D) loop banaa (RC-LH114-W) ykn loop cufame (RC-LH116) uuma. Baandii 877 nm RC-LH114-W wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu, jijjiiramni diimaan xuuxuu 880 nm RC-LH116 3 nm dha (Fakkii 2A). Haa ta’u malee, ispeektirii daayikirooyizimii geengoo wal fakkaata jechuun ni danda’ama (Fakkii 2B), kunis garaagarummaan ifa ta’e loopoota banaa fi cufame gidduu jiraatus, naannoon naannoo BChls baay’ee walfakkaata ta’uu agarsiisa. Xuuxamuu diimaan bu’aa sochii ho’aa hir’achuu fi tasgabbii dabaluu loop cufame irratti (18, 19), jijjiirama walqabsiisa pigmentii loop cufame (20, 21), ykn walnyaatinsa bu’aa lamaan kanaa (11) ta’uu danda’a.
(A) Ispeektirii xuuxuu altiraavaayoleetii/mul’ata/infrared dhiyoo, fiixeewwan isaanii pigmentii isaanii walgitan waliin mallatteeffamanii fi fiixee BPh 775 nm irratti normalize ta’aniiru. (B) Ispeektirii daayikirooyizimii geengoo gara xuuxuu BChl 805 nm irratti normalize ta’e. (C fi D) Ispeektaroota ΔA filataman ispeektaroota xuuxuu yeroon furmaata argatan kompileeksii RC-LH114-W (C) fi kompileeksii RC-LH116 (D) irraa. Walbira qabamuu fooyya’aa ta’eef, ispeektaroonni hundi gara ∆A −A 0.2 ps irratti normalize ta’u. (E) Saffisa oksideeshinii saayitookiroomii c2 erga irradiation booda bakka qindoominni UQ2 adda addaa jirutti (daataa raw ilaaluuf fakkii S8 ilaali). (F) Seelii ifa cimina gadi aanaa, giddu galeessaa ykn guddaa (10, 30 ykn 300μMm-2 s-1, akkaataa walduraa duubaan) jalatti guddatan keessatti, pirootiinii W fi RC-L subunitii kompileeksii qulqullaa’ee fi reeshiyoo meembraanii adda baafame keessatti. Sadarkaa pirootiinii SDS-polyacrylamide gel electrophoresis fi immunoassay tiin murteessuu (daataa raw ilaaluuf Fakkii S9 ilaali). Reeshiyoo kompileeksii RC-LH114-W qulqullaa’ee wajjin walqabatee murteessuu. Reeshiyoon istookiyoomeetirii RC-L fi pirootiinii-W kompileeksii 1:1 dha.
BChls bakka 1 irratti loop αβ14 deformed RC-LH114-W (Fakkii 1, A, C, fi E) keessatti argaman RC-LH116 keessatti BChls walqixa ta’an caalaa 6.8Å arjooma jalqabaa RC (P)tti dhihoo dha (Fakkii. 1, B, D, fi F, fi Fakkii S3); haa ta’u malee, sochiin xuuxuu darbaa kompileeksoota lamaan RC-LH114-W fi RC-LH116 tiif, dhaabbataa yeroo dabarsuu anniisaa kaka’umsaa LH1 irraa gara RCtti 40 ±4 fi 44±3 ps akka ta’e agarsiisa (Fakkii 2). , C fi D, Fakkii S4 fi Gabatee S2). Akkasumas RC keessatti garaagarummaan guddaan dabarsoo elektirooniksii hin jiru (Fakkii S5 fi barreeffama dabalataa walqabatee). Walsimsiisni dhiyeenyaa yeroon dabarsoo anniisaa LH1 fi RC-P gidduu jiru fageenya, kofa fi anniisaa pooteenshaala BChl irra caalaan loopoota LH1 lamaan keessatti walfakkaataa ta’uu isaa shakkina. Fageenya xiqqaa irra ga’uuf akkaataa anniisaa LH1 qorachuun kallattiin anniisaa iddoowwan suboptimal irraa gara RCtti dabarsuu caalaa saffisaa waan hin taane fakkaata. Looppii LH1 banaa-looppii RC-LH114-W keessattis xiinxala caasaadhaaf haala ho’a gadi aanaa jalatti sochii ho’aa xiqqaa ta’e keessa darbuu danda’a, akkasumas fageenya pigmentation βBChls bakka RC 1 irraa ho’a kutaa keessatti konfoormeeshiniin gilgaala αβ14 dheeraa ta’e ni jira.
Kompileeksiin RC-LH116 BChls 32 fi karootinooyidii 16 kan of keessaa qabu yoo ta’u, qophiin isaa waliigalaa kan Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain ( PDB ID 7C9R) (12) fi magariisa irraa argamee wajjin tokko algee (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) jedhamuun beekama. Erga qindaa’anii booda, bakka αβ heterodimers keessatti jijjiirama xixiqqoo qofatu mul’ateera, keessumaa 1-5, 15, fi 16 (Fakkii S6). Argamuun pirootiinii-W caasaa LH1 irratti dhiibbaa guddaa qaba. TMHn isaa sadan loopoota gabaabaatiin kan walqabate yoo ta’u, N-terminal gama lumen kompileeksii fi C-terminal gama cytoplasmic irratti (Fakkii 1A fi 3, A hanga D). Pirootiiniin-W baay’inaan haayidiroofobiik dha (Fakkii 3B), TMH2 fi TMH3 LH1αβ-14 waliin wal-nyaachuun fuula meembraanii qaxxaamuraa uumu (Fakkii 3, B fi E hanga G). Interfeesichi irra caalaa haftee Phe, Leu fi Val naannoo transmembrane keessatti argamu irraa kan ijaarame dha. Hafteen kunniin amiinoo asiidota haayidiroofobiikii fi pigmentii αβ-14 waliin walitti tuulama. Hafteen poolaarii tokko tokkos walnyaatinsa kanaaf gumaacha, hidhoo haayidiroojiinii W-Thr68 fi β-Trp42 gidduu jiru fuula qaawwa walxaxaa irratti dabalatee (Fakkii 3, F fi G). Fuula saayitoopilaasmii irratti Gln34 garee keetoo karootinooyidii αβ-14tti dhihoo dha. Dabalataanis, molakiyuuliin n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) furmaata argateera, fi funyaan isaa haayidiroofobiikii gara walqunnamtii pirootiinii-W fi αβ-14 gidduu jirutti kan babal’ate yoo ta’u, funyaan lipidii qaama keessatti argamu danda’a. Akkasumas naannoowwan furmaata C-terminal pirootiinii W fi RCH baayyee walitti dhihoo ta'uu isaanii hubanneerra, garuu daangaa wal-nyaatinsa addaa uumuu keessa akka hin taane (Fakkii 1, A fi E). Haa ta’u malee, amiinoo asiidota C-terminal hin furamne pirootiinota kana lamaan keessatti wal-nyaatinsi jiraachuu danda’a, kunis yeroo walgahii kompileeksii RC-LH114-W pirootiinii-W bobbaasuuf mala kennuu danda’a.
(A) Pirootiinii-W, kan bifa kaartuuniin LH1αβ14 waliin walqunnamtii fuuldura jiru, sansalata cinaa boca ulee qabu (diimaa) qaba, kutaa diyaagiraamii pooteenshaala elektiroo-istaatikii keessatti agarsiifame (fuula halluu diimaa iftoomina qabu sadarkaa kontooraa 0.13 qabu). (B) Pirootiinii-W kan bakka bu’u fuula halluu haayidiroofobiikii qabuun. Naannoowwan poolaarii fi chaarjii qaban saayiniin, naannoowwan haayidiroofobiik adiin, naannoowwan haayidiroofobiik ciccimoo ta’an ammoo burtukaanaan agarsiifamu. (C fi D) Pirootiinii-W kaartuunii keessatti bakka bu’e, orienteeshiniin isaa akkuma (A) (C) keessatti, fi 180° (D)n naanneffama. Akkaataa bakka tartiiba keessatti argamutti, haftoonni adda baafamuu danda’an halluu bokkaa kan fudhatu yoo ta’u, bakka N-terminal halluu diimaa fi C-terminal diimaa ta’etti. (E) Pirootiinii-W ilaalcha walfakkaataa (A) keessatti, fi haftee walqunnamtii pirootiinii-W:LH1 irratti argamu uleewwan mallattoo walitti hidhame qabaniin bakka bu’u. (F) Pirootiiniin-W bakka bu’iinsa kaartuunii keessatti (E) fi LH1αβ14 wajjin walqabatee, fi bakka bu’iinsa bar keessatti haftee walqunnamtii wajjin walqabatee 90° naanneffama. Hafteen olka’aa poliipeeptiidii beetaa irraa argamu mallatteeffameera. Koofaaktarichi akka barruu halluu fakkii 1 wajjin walsimutti agarsiifameera, β-DDM diigame halluu diimaatiin agarsiifameera, oksijiiniin immoo diimaan agarsiifameera. (G) Mul’anni (F) keessatti argamu 180° kan naanneffame yoo ta’u, haftee mul’ataa alfaa poliipeeptiidii mallatteeffame waliin.
Pirootiiniin-W αβ heterodimer bakka bu’a (fakkii 1F irratti 15ffaa), kanaanis cufamuu loop ittisa fi heterodimers αβ sadan jalqabaa garagalcha. Kofoon inkliinshinii ol’aanaa αβ-1 heterodimer jalqabaa film normal wajjin walqabatee 25° hanga 29° akka ta’e ilaalameera (Fakkii 1, A fi E), kunis RC A sharp contrast-LH116 keessatti 2° hanga 8° inclination αβ-1 (Fakkii 1, B fi F) keessatti uumame. Heeteroodaayimaroonni lammaffaa fi sadaffaan akkaataa walduraa duubaan 12° hanga 22° fi 5° hanga 10°tti kan inkliin ta’u. Sababa gufuu steric RC, tilt αβ-1 lamaan lammaffaa αβ (kan fakkii 1F αβ 16ffaa wajjin walsimu) hin dabalatu, kanaaf qaawwa ifa ta'e LH1 ring keessatti uuma (Fakkii 1, A fi E) . Sababa hanqina αβ heterodimers lama, dhabuu BChl afur fi carotenoids lama waliin, carotenoids tokkollee subunitii αβ-1 qaxxaamuree wajjin hin hidhamne, bu’aan isaas LH114-W ring carotenoids 13 Vegetarian fi 28 BChls of keessaa qabu uuma. Tilmaamni furmaata naannoo kompileeksoota lamaan naannoo αβ1 hanga 7 keessatti kanneen loop LH1 hafe irraa gadi aanaadha, kunis pilaastikii uumamaan subunitii LH1 bakka RC QBtti dhihoo jiru calaqqisiisuu danda’a (Fakkii 4) .
Suuraaleen RC-LH114-W (A fi B) fi RC-LH116 (C fi D) ilaalcha gubbaa/ilaalcha cinaa walfakkaataa (A fi B) (A fi C) fi fuula qaawwa Fak.1. (B fi D) irraa agarsiifamaniiru. Furtuuwwan halluu qaban gara mirgaatti agarsiifamu.
Kompileeksiin wiirtuu amala biraa kan reeshiyoo istookiyoomeetrikii 1:14 qabu Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13) qofaadha. Haa ta’u malee, pirootiiniin W fi PufX homology ifa ta’e hin qaban, akkasumas caasaa LH1 isaanii irratti dhiibbaa guddaa qabu. PufX TMH tokkicha domeenii saayitoopilaasmii N-terminal qabuu fi gama saayitoopilaasmii subunitii RC-H (13) wajjin bakka Rps wajjin walsimutti wal-nyaatudha. palustris LH116αβ-16 jedhamuun beekama. PufX RC-LH1 fi kompileeksii saayitookiroomii bcl gidduutti jijjiirraa kinoonii/kiinoolooniif chaanaalii kan uumu yoo ta’u Rba hunda keessatti argama. kompileeksii wiirtuu isphaeroides (13). Walqunnamtiin monoomarii-monoomarii Rba keessatti ta’us. Sphaeroides RC-LH1-PufX dimer bakka hidhuu pirootiinii W RC-LH114-W keessatti kan argamu yoo ta’u, qaawwi PufX fi pirootiinii-Wn kakaafame bakka walqixa ta’etti argama (Fakkii S7A). Qaawwi RC-LH114-W keessattis chaanaalii kinoonii yaadame (8) Pseudomonas rosea LH1, kan peeptiidota pirootiinii W ykn PufX waliin wal hin qabanneen uumame waliinis walsima (Fakkii S7B). Kana malees, chaanaalii kiniinii Blc. LH1 magariisa emeraaldii γ subunitii tokko (7) hambisuun uumame bakka walfakkaatutti argama (Fakkii S7C). Pirootinoota adda addaatiin gidduu galeessa ta’us, mul’achuun chaanaalii kinoonii/kiinooloolii kanaa bakka waliigalaa kompileeksii RC-LH1 keessatti fakkeenya jijjiirama walitti dhufeenyaa ta’ee mul’ata, kunis qaawwi pirootiinii W uumamu akka chaanaalii kinooniitti hojjechuu akka danda’u agarsiisa.
Qaawwi loop LH114-W keessa jiru akka pirootiinotaatti domeenii lamaan karaa qola pirootiinii walitti hidhuu irra, naannoo meembraanii walitti fufiinsa qabu bakka keessoo kompileeksii RC-LH114-W fi meembraanii hedduu gidduutti akka uumamu hayyama. Kompileeksiin RC-LH116 Tch cufame wajjin wal fakkaata. Kompileeksii cirracha fakkaatu (22) (Fakkii 1H). Faca’iinsi kinoonii karaa meembraanii babal’ina karaa pirootiinii dhiphoo caalaa saffisaa waan ta’eef, loop LH114-W banaa loop LH116 cufame caalaa jijjiirraa RC saffisaa hayyamuu danda’a, akkasumas babal’inni kinoonii gara RCtti caalaatti daangeffamuu danda’a. Pirootiiniin W jijjiirraa kinoonii karaa RC irratti dhiibbaa qabaachuu isaa qorachuuf, qorannoo oksideeshinii saayitookiroomii qindoomina murtaa'e ubiquinone 2 (UQ2) (analoogii uumamaa UQ10 kan funyaan isoprene gabaabaa qabu) irratti raawwanne (Fakkii 2E). Argamuun chelated quinone murtee sirrii dhaabbataa Michaelis mul'atu gufachiisa ta'us (RC-LH114-W fi RC-LH116 0.2±0.1μM fi 0.5±0.2μM, akkaataa wal duraa duubaan mijatoo dha), saffisi ol'aanaa RC-LH114-W ( 4.6±0.2 e-RC-1 s-1) dha RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) caalaa %28±5 guddaadha.
Jalqaba irratti pirootiiniin-W gara %10 kompileeksii wiirtuu keessatti akka argamu tilmaamne (16); asitti, saffisi qabannaa seelii guddinaa ifa xiqqaa, ifa giddu galeessaa fi ifa guddaa qabu 15±0.6%, 11±1% fi 0.9±0.5, akkaataa walduraa duubaan % (Fakkii 2F). Walbira qabamee yoo ilaalamu baay’inaan ispeektiroomeetirii baay’inaan histidine tag dabaluudhaan baay’ina pirootiinii-W gosoota gosa bosona (P = 0.59) wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu akka hin hir’isne agarsiise, kanaaf sadarkaaleen kun artiifaaktii pirootiinii-W fooyya’e miti (Fakkii S10). Haa ta'u malee, qabamni pirootiinii-W gadi aanaan kun kompileeksii RC-LH1 keessatti RCn tokko tokko saffisa ariifataadhaan akka garagalchan hayyamuu danda'a, kanaanis jijjiirraa kinoonii/kiinooloonii suuta jedhu kompileeksii RC-LH116 keessatti salphisa. Saffisi qabannaa ifaa olaanaa daataa tiraanskriiptoomiksii dhiheenya kanaa wajjin kan wal hin simne ta’uu hubanneerra, kunis ibsa jiinii pufW ifa cimaa jalatti akka dabalu agarsiisa (Fakkii S11) (23). Garaagarummaan tiraanskriipshinii pufW fi pirootiinii-W kompileeksii RC-LH1 keessatti hammachuu gidduu jiru burjaaja’aa fi dambii walxaxaa pirootiinii calaqqisiisuu danda’a.
RC-LH114-W keessatti, molakiyuulonni kaardiyooliipiinii (CDL) 6, fosfatiidiilkooliin (POPC) 7, fosfatidiilgiliseroolii (POPG) 1 fi β-DDM 29 ramadamanii moodeela ta’aniiru. RC-LH116 (Fakkii 5, A fi B). Caasaa lamaan kana keessatti CDL gama saayitoopilaasmii kompileeksii irratti kan argamu yoo ta’u, POPC, POPG fi β-DDM ammoo irra caalaa gama luminal irratti argamu. Molekuloonni lipidii fi saamunaan lama naannoo αβ-1 hanga αβ-6 kompileeksii RC-LH114-W keessatti adda baafamaniiru (Fakkii 5A), shan ammoo naannoo walqixa RC-LH116 keessatti adda baafamaniiru (Fakkii 5B). Lipiidonni baay’een gama biraa kompileeksii, irra caalaa CDL, RC fi αβ-7 hanga αβ-13 gidduutti kuufaman argameera (Fakkii 5, A fi B). Lipiidotaa fi saamunaan biroo caasaadhaan furmaata argatan gilgaala LH1 ala kan argaman yoo ta’u, sansalatni asiilii akka gaariitti furmaata argate subunitii LH1 gidduutti kan diriiru yoo ta’u, yeroodhaaf RC-LH114-W keessatti β-DDM jedhamee kan moggaafame, fi RC A keessatti makaa β-DDM fi POPC-LH116 keessatti β-DDM jedhamee kan ibsame. Bakki walfakkaataan lipiidotaa fi saamunaan chelating caasaa keenya keessatti iddoowwan hidhuu fiiziyoloojiidhaan barbaachisoo ta’uu isaanii agarsiisa (Fakkii S12A). Bakki molakiyuulota walqixaa Tch keessatti argamanis walsimannaa gaarii qabu. Lallaafaa fi Trv. Gosti 970 RC-LH1s (Fakkii S12, B hanga E) (9, 12) fi haftee haayidiroojiinii-hidhachuu garee mataa lipidii tartiiba walsimsiisa keessatti kunuunsa gaarii agarsiisan (Fakkii S13), kunis Conserved CDL kan RC (24)tti hidhu, iddoowwan kun kompileeksii RC-LH1 keessatti kunuunfamuu akka danda'an agarsiisa.
(A fi B) Peeptiidonni RC-LH114-W (A) fi RC-LH116 (B) kaartuuniin kan bakka bu’an yoo ta’u, pigmentiiwwan immoo uleedhaan kan bakka bu’an yoo ta’u, fakkii 1 irratti mul’atu fayyadamuun. UQn iddoowwan RC QA fi QBtti hidhamee keelloo yoo ta’u, UQn adda baafame ammoo halluu diimaa qaba. (C fi D) Ilaalcha (A) fi (B) wajjin walfakkaatu, lipiidonni kan hafe. (E hanga G) Mul’ata guddate Q1(E), Q2(F) fi Q3(G) RC-LH116 irraa, sansalata cinaa kan dhiibbaa walirratti dhiibbaa geessisu. Hidhoonni haayidiroojiinii akka sarara qaxxaamuraa gurraachaatti agarsiifamu.
RC-LH116 keessatti, RC QA fi QB UQ lamaan isaanii, kanneen adeemsa addaan bahuu chaarjii keessatti dabarsuu elektiroonii keessatti hirmaatan, bakka hidhuu isaanii keessatti ni diigamu. Haa ta’u malee RC-LH114-W keessatti QB quinone furmaata waan hin arganneef armaan gaditti bal’inaan ni ilaalama. QA fi QB quinones malees, molakiyuulonni UQ chelated lama (kan RC fi LH1 ring gidduutti argaman) akkaataa garee mataa isaanii kan akka gaariitti furmaata argateen (Q1 fi Q2 keessatti argaman, akkaataa walduraa duubaan) caasaa RC-LH114-W keessatti ramadamu. bakka). Fakkii 5C). Yuunitiin isoprene lama Q1tti ramadama, kaartaan density immoo funyaan isoprene 10 guutuu Q2 furmaata kenna. Caasaa RC-LH116 keessatti, molakiyuulonni UQ10 chelated sadii (Q1 hanga Q3, Fakkii 5D) furmaata kan argatan yoo ta’u, molakiyuulonni hundinuu guutummaa funyaan isaanii keessatti dhangala’aa ifa ta’e qabu (Fakkii 5, D hanga G). Caasaa lamaan keessatti, bakki gareewwan mataa kinoonii Q1 fi Q2 walsimannaa gaarii qabu (Fakkii S12F), akkasumas RC qofa waliin wal-nyaatu. Q1 seensa qaawwa W RC-LH114-W (Fakkii 1G fi 5, C, D fi E) irratti kan argamu yoo ta’u, Q2 ammoo naannoo bakka hidhaa QB (Fakkii 5, C, D) fi F) argama. Hafteen L-Trp143 fi L-Trp269 kunuunfame Q1 fi Q2tti baay’ee kan dhihoo ta’ee fi wal-nyaatinsa π-tuulamuu danda’u kan kennudha (Fakkii 5, E fi F, fi Fakkii S12). L-Gln88, oksijiinii fagoo Q1 irraa 3.0 Å, hidhoo haayidiroojiinii cimaa kenna (Fakkii 5E); hafteen kun hariiroo baay’ee fagoo ta’e irraa kan hafe RC hunda keessatti eegameera (Fakkii S13). L-Ser91 RC biroo irra caalaan isaanii keessatti Thr bakka bu’ee konsarvaatiivii ta’ee jira (Fakkii S13), oksijiinii meetiilii Q1 irraa Angstroms 3.8 dha, akkasumas hidhoo haayidiroojiinii dadhabaa kennuu danda’a (Fakkii 5E). Q3 wal-nyaatinsa addaa kan qabu hin fakkaatu, garuu naannoo haayidiroofobiik subunitii RC-M fi subunitii LH1-α 5 hanga 6 gidduutti argama (Fakkii 5, D fi G). Q1, Q2 fi Q3 ykn kinoonoonni chelated dhiyoo jiran Tch keessattis furmaata argataniiru. Lallaafaa, Trv. Gosti 970 fi Blc. Caasaan iriisii ​​(9, 10, 12) kompileeksii RC-LH1 keessatti bakka hidhuu kinoonii gargaaraa eegame agarsiisa (Fakkii S12G). UQn shanan RC-LH116 keessatti manca’an tokkoon tokkoon kompileeksii 5.8±0.7 kan dhangala’aa kiroomaatoogiraafii ga’umsa olaanaadhaan (HPLC) murtaa’e waliin waliigaltee gaarii kan qaban yoo ta’u, UQn sadan RC-LH114-W keessatti manca’an ammoo gadi aanaadha Gatiin safarame 6.2±0.3 (Fak. S14) caasaa keessatti molakiyuulonni UQ furmaata hin arganne akka jiran agarsiisa.
Poolipeeptiidonni L fi M sobaa simeetrikii tokkoon tokkoon isaanii TMH shan kan of keessaa qaban yoo ta’u, heeteroodaayimarii kan BChl daayimarii tokko, monoomaroota BChl lama, monoomaroota baakteeriyoofeejii (BPh) lama, fi sibiilli Heemii hin taane tokkoo fi molakiyuulota UQ10 tokko ykn lama walitti fidu uumu. Garee keetoonii xumuraa irratti hidhoo haayidiroojiinii jiraachuu fi kuufama isaa beekamaa Rps keessatti, karootinooyidoonni M-subunit keessatti hammatamu, kunis cis-3,4-dehydroorhodopin jedhama. Gosa (25). Domeeniin meembraanii alaa RC-H TMH tokkoon meembraanii irratti hidhamee jira. Caasaan RC waliigalaa RC subunitii sadan gosoota walqabatan (kan akka Rba) wajjin walfakkaata. isfeerooyidii (PDB ID: 3I4D) jedhamuun beekama. Maakroosaayikiliin BChl fi BPh, lafee dugdaa karootinooyidii fi sibiilli heemii hin taane daangaa furmaata caasaa kanaa keessatti wal-irra bu’u, akkuma gareen mataa UQ10 bakka QA fi QB kinoon RC-LH116 (Fakkii S15).
Caasaaleen RC lamaa saffisa qabannaa iddoo QB adda addaa qaban jiraachuun isaanii jijjiirama konfoormeeshinii walfakkaatu hidhachuu QB kinoonii waliin dhufu qorachuuf carraa haaraa kenna. Kompileeksii RC-LH116 keessatti, QB quinone bakka “proximal” guutummaatti hidhamee jirutti argama (26), garuu addaan bahuun RC-LH114-W QB quinone hin qabu. RC-LH114-W keessatti QB quinone hin jiru, kunis kan nama ajaa’ibu sababiin isaas kompileeksiin sochii waan qabuuf, kompileeksii RC-LH116 kan caasaan furmaata QB quinone qabu caalaa. Gingilchaan LH1 lamaan gara kinoonii ja’a chelate ta’us, shan gilgaala RC-LH116 cufame keessatti caasaadhaan kan furmaata argate yoo ta’u, gingilchaa RC-LH114-W banaa keessatti caasaadhaan kan daangeffame sadii qofa . Jeeqamni caasaa dabale kun saffisaan bakka buufamuu iddoowwan RC-LH114-W QB, sochii kineetikii saffisaa kompileeksii keessatti, fi carraan loop LH1 qaxxaamuruu dabaluu calaqqisiisuu danda’a. Hanqinni UQ bakka RC QB RC-LH114-W keessatti bu'aa kompileeksii caalaatti walxaxaa fi sochii guddaa ta'e ta'uu akka danda'u yaada dhiyeessina, akkasumas bakki QB RC-LH114-W battalumatti jijjiirraa UQ keessatti qabbanaa'eera Sadarkaan addaa (seensa iddoo QB cufamee jira) konfoormeeshinii sochii kanaa calaqqisiisa.
QB malee, naanneffamni L-Phe217 waliin dhufu gara bakka hidhata UQ10 wajjin wal hin simnetti, sababiin isaas yuunitii isoprene isa jalqabaa funyaan waliin walitti bu’iinsa iddoo ni fida (Fakkii 6A). Dabalataanis, jijjiiramni konfoormeeshinii ijoo ifa ta’e ifaadha, keessumaa heeliiksii de (heeliiksii gabaabaa loop TMH D fi E gidduu jiru keessatti) bakka L-Phe217 gara kiisha hidhaa QB fi naanneffannaa L-Tyr223tti jijjiiramu (Fakkii 6A ) Hidhoo haayidiroojiinii M-Asp45 framework waliin cabsuu fi seensa iddoo hidhaa QB cufuuf (Fakkii 6B) jedhu. Heeliiksiin bu’uura isaa irratti de pivots yoo ta’u, Cα L-Ser209 0.33Ån kan jijjiiramu yoo ta’u, L-Val221Cα ammoo 3.52Ån jijjiirama. TMH D fi E keessatti jijjiiramni mul’atu hin jiru, isaanis caasaa lamaan keessatti kan wal-irratti kaa’aman (Fakkii 6A). Hanga beeknutti kun caasaa jalqabaa RC uumamaa keessatti bakka QB cufudha. Caasaa guutuu (QB-bound) wajjin wal bira qabamee yoo ilaalamu, kuinooniin osoo hin hir’atin dura, jijjiiramni konfoormeeshinii akka inni kuinoonii keessa seenu gochuuf akka barbaachisu agarsiisa. L-Phe217 garee mataa kinoonii wajjin wal-nyaatinsa π-tuullaa uumuuf naanna’a, heeliksiinis gara alaatti kan ce’u yoo ta’u, kunis lafeen L-Gly222 fi sansalata cinaa L-Tyr223 caasaa hidhoo haayidiroojiinii tasgabbaa’aa qabu toora hidhoo haayidiroojiinii akka uumuuf hayyama (Fakkii 6, A fi C).
(A) Kaartuunii wal-irratti wal-caalu kan hologiraamii (sansalata L, sansalata burtukaana/M, maajeentaa) fi caasaa apo (halluu diimaa), kan haftee furtuu bifa bakka bu’iinsa ulee fakkaatuun agarsiifamu. UQ10 barruu keellootiin bakka bu’a. Sararri tuqaa qabu hidhoo haayidiroojiinii guutummaa caasaa keessatti uumame agarsiisa. (B fi C) Bakka bu’iinsa fuula apolipoprotein fi caasaa gilgaala guutuu, oksijiinii sansalata cinaa L-Phe217 halluu diimaa fi L-Tyr223 diimaatiin calaqqisiisu, akkaataa wal duraa duubaan. Yuunitiin xiqqaan L burtukaana dha; yuunitiin xiqqaan M fi H halluu hin qaban. (D fi E) Iddoowwan RC QB apolipoprotein (D) fi guutuu (E) [halluu (A) tiin] fi Thermophilus thermophilus PSII (magariisa, halluu diimaa pilaastikii kinoonii wajjin; PDB ID: 3WU2) Hiriirsi (58).
Akka hin eegamnetti, caasaan RC hanqina QB qaban hedduun LH1 hin qabne jiraatanis, jijjiiramni konfoormeeshinii qorannoo kana keessatti mul’ate kanaan dura hin gabaafamne. Isaan keessaa caasaa QB hir’isuu Blc irraa. viridis (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) fi Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), hundi isaanii caasaa QB waliigalaa isaanii wajjin tokko jechuun ni danda’ama. 3PRC dhiyeenyaan ilaaluun molakiyuulonni saamunaan LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) seensa bakka QB irratti akka hidhaman kan mul’ate yoo ta’u, kunis gara konfoormeeshinii cufameetti irra deebi’anii akka hin qindaa’in dhorkuu danda’a. LDAO 1EYS ykn 1OGV keessatti bakka walfakkaatutti kan hin mancaane ta’us, RCn kunniin saamunaan walfakkaataa fayyadamuun kan qophaa’an waan ta’eef bu’aa walfakkaatu uumuu danda’u. Caasaan kiristaala Rba. Sphaeroides RC cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) waliin co-crystallized ta’es bakka QB cufame waan qabu fakkaata. Haa ta'u malee, haala kana keessatti, naannoon N-terminal poliipeeptiidii RC-M (karaa hidhoo H haftee Tyr Q helix irratti iddoo hidhuu QB waliin wal-qunnamtii) konfoormeeshinii uumamaa hin taane fudhata, jijjiiramni konfoormeeshinii QB immoo caalaatti hin qoratamu (30 ). Wanti nama tasgabbeessu gosa difoormeeshinii kanaa kan poliipeeptiidii M caasaa RC-LH114-W keessatti hin argine, kunis naannoo N-terminal RC-LH116 RC wajjin wal fakkaata jechuun ni danda'ama. Akkasumas hubatamuu qaba, erga anteenaa LH1 saamunaan irratti hundaa’e dhabamsiifamee booda, RCn apolipoprotein PDB keessatti argaman furmaata argachuun isaanii, poolii kinoonii fi lipiidota keessaa qaawwa RC fi fuula keessaa gilgaala LH1 naannoo jiru gidduu jiru dhabamsiiseera (31, 32). RCn hojii isaa kan itti fufu sababni isaas koofaaktaroota hunda waan qabatuuf, QB quinone kan manca’uu danda’u irraa kan hafe, kunis tasgabbaa’aa kan hin taanee fi yeroo baay’ee adeemsa qophii keessatti kan badudha (33). Dabalataanis, LH1 fi lipiidota marsaa uumamaa RC irraa buqqisuun dalagaalee irratti dhiibbaa qabaachuu akka danda’u beekamaadha, kanneen akka umurii gabaabsuu haala P+QB chaarjiidhaan adda baafame (31, 34, 35). Kanaafuu, jiraachuun gilgaala LH1 naannoo RC marsee jiru iddoo QB “cufame” eeguu danda’a, kanaanis naannoo naannoo naannoo QB jiru kunuunsuu danda’a jennee tilmaamna.
Apolipoprotein (QB quinone malee) fi caasaan guutuun taateewwan walduraa duubaan raawwataman osoo hin taane, suuraa lama qofa kan bakka bu’an ta’us, hidhuun sun deebi’ee hidhuu haayidirookiinooniin akka hin hidhamneef Gated ta’uu akka danda’u Inhibiishinii substrate dhorkuuf. Wal-nyaatinsi kinoololii fi kinoonii naannoo bakka QB apolipoprotein adda ta’uu danda’a, kunis RCn akka didu isa taasisa. Jijjiiramni konfoormeeshinii hidhuu fi hir’isuu kinoonii keessatti gahee akka qabu yeroo dheeraaf yaadameera. Dandeettiin RCn qorraa erga madaqfamuu dukkanaa booda kinoonii hir’isuu ni miidhama (36); X-ray crystallography akka agarsiisutti miidhaa kun sababa QB quinones “distal” conformation gara 4.5 Å bakka active proximal position irraa (26) , 37) “distal” conformation keessatti qabamuu isaati. Konfoormeeshiniin hidhaa fagoo kun suuraa haala gidduugaleessaa apolipoprotein fi caasaa gilgaala guutuu gidduu jiruu ta'uu isaa yaada, kunis wal-nyaatinsa jalqabaa kinoonii fi banamuu iddoo QB hordofa.
Gosti II RC kompileeksii PSII baakteeriyaa foototroofiik murtaa’oo fi saayinoobaakteeriyaa, algee fi biqiltoota keessatti argamu kunuunsa caasaa fi dalagaa qaba ( 38 ). Hiriirri caasaa fakkii 6 (D fi E) irratti agarsiifame walfakkeenya PSII RC fi iddoo QB kompileeksii RC baakteeriyaa gidduu jiru cimsee ibsa. Walbira qabamuun kun yeroo dheeraaf sirnoota walitti dhiyeenyaan walqabatan kan hidhuu fi hir’isuu kinoonii qorachuuf moodeela ta’ee ture. Maxxansi kanaan duraa jijjiiramni konfoormeeshinii PSII hir’isuu kinoonii wajjin akka ta’u yaada dhiyeessan (39, 40). Kanaafuu, kunuunsa jijjiirama RC ilaalcha keessa galchuun, mala hidhuu kanaan dura hin ilaalamne kun biqiltoota foototroofii oksijiinii qaban keessatti iddoo QB PSII RC irrattis hojiirra ooluu danda’a.
Rps ΔpufW (haquu pufW hin mallatteeffamne) fi PufW-His (C-terminal 10x His-tagged pirootiinii-W bakka pufW uumamaa irraa ibsame) gosoota. palustris CGA009 hojii keenya kanaan duraa keessatti ibsameera (16). Gosoonni kunniin fi warri gosa bosona isogenic seelii lakkoofsa xiqqaa PYE (tokkoon tokkoon isaanii 5 g liitira -1) (LB keessatti -80 °C irratti kuufame, 50% ( w/v) glycerol) pirootiinii, damma extract fi succinate of keessaa qabu) agar [1.5% (w/v)] plate irratti streaking gochuun freezer irraa deebifamaniiru. Fuulli kun halkan tokkoof dukkana keessatti ho’a kutaa keessatti haala anaeroobikii jalatti inkuubeer ta’ee, achiis ifa adii (~50 μmolm-2 s-1) OSRAM 116-W halogen bulbs (RS Components, UK) tiin guyyoota 3 hanga 5f hanga koloniin tokko mul’atutti ibsame. Koloniin tokko meediyaa M22+ (41) 10 ml kan 0.1% (w/v) kasaaminoo asiidota (kana booda M22 jedhamee waamamu) dabalame talaaluuf itti fayyadameera. Aadaan haala oksijiinii gadi aanaa jalatti dukkana keessatti 34°C irratti 180 rpm sa’aatii 48f raafamuudhaan guddate, sana booda aadaan 70 ml haala walfakkaatuun sa’aatii 24f talaalameera. Aadaan walakkaa eroobikii ulfaatina 1 ml qabu qaruuraa geejjibaa iftoomina qabu kan universal screw-top 30 ml keessatti meediyaa M22 30 ml talaaluun humna maagneetii sterile ta’een sa’aatii 48f jeequmsa (~50μmolm-2 s-1) tiin irradiated gochuuf fayyadama. Sana booda aadaan 30 ml aadaa gara liitira 1 haala walfakkaatuun talaalamee, sana booda aadaa gara liitira 9 ~200 μmolm-2 s-1 irratti ibsame sa’aatii 72f talaaluuf itti fayyadame. Seelonni daqiiqaa 30f 7132 RCF irratti seentiriifiigeeshiniin sassaabamaniiru, ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) keessatti deebi’anii suspended, fi hanga barbaachisutti -20°C irratti kuufamaniiru.
Erga qabbanaa’ee booda, seelii deebi’ee dhaabbate irratti kiristaalota tokko tokko deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) fi Roche holoenzyme protease inhibitor tablets lama (Merck, UK) dabaluu. Seelii dhiibbaa Faransaay 20,000 psi (Aminco, USA) keessatti seelonni yeroo 8 hanga 12 jeeqamaniiru. Seelii hin cabnee fi caccabaa hin bulbulamne 18,500 RCF irratti daqiiqaa 15f 4°C irratti seentiriifiigeeshiniin erga baafamee booda, meembraanichi 113,000 RCF irratti sa’aatii 2f 43,000°C irratti seentiriifiigeeshiniin laayizeetii pigmented irraa boba’e. Firaakshinii bulbulamaa sana gatuudhaan meembraanii halluu qabu 20 mM tris-HCl (pH 8.0) 100 hanga 200 ml keessatti deebi’anii dhaabuun hanga walitti qabaan mul’atu hin jirretti homogenize gochuu. Meembraaniin dhaabbate 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) 2% (w/v) β-DDM of keessaa qabu keessatti sa’aatii 1f dukkana keessatti 4°C irratti suuta sochoosuun inkuubeer ta’e. Sana booda 70°C irratti seentirifuujii gochuun RCF 150,000 4°C irratti sa’aatii 1f bulbulamee haftee hin bulbulamne balleessuuf.
Meembraaniin bulbulamaa gosa ΔpufW irraa argame tarree jijjiirraa ayoon DEAE Sepharose 50 ml kan jildii tarree sadii (CV) baafaara hidhuu [20 mM tris-HCl (pH 8.0) 0.03% (w / v) β-DDM of keessaa qabu] irratti dibame. Tarree sana baafaroota hidhuu CV lamaatiin dhiqadhu, achiis tarree sana baafaroota hidhuu lama 50 mM NaCl of keessaa qabuun dhiqadhu. Kompileeksiin RC-LH116 1.75 CV irratti 150 hanga 300 mM NaCl (baafara hidhuu keessatti) sararaan kan dhiqame yoo ta’u, kompileeksiin hidhuu hafe ammoo 0.5 CV irratti baafaara hidhuu 300 mM NaCl of keessaa qabuun kan dhiqame ture. Ispeektirii xuuxuu 250 fi 1000 nm gidduutti walitti qabuu, firaakshinii reeshiyoo xuuxuu (A880/A280) 1 ol qabu 880 hanga 280 nm irratti eeguu, baafaara hidhuu keessatti si’a lama diilalla’uu, fi ammas adeemsa walfakkaatu tarjaa DEAE irratti fayyadamuu On purification. Firaakshinoota reeshiyoo A880/A280 1.7 ol fi reeshiyoo A880/A805 3.0 ol qaban diilalla’uu, jijjiirraa ayoon marsaa sadaffaa raawwachuu, fi firaakshinoota reeshiyoo A880/A280 2.2 ol fi reeshiyoo A880/A805 5.0 ol qaban qabachuu. Kompileeksii gartokkoon qulqullaa’e kun Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) centrifugal filter (Merck, UK) keessatti hanga ~2 ml tti kan walitti qabame yoo ta’u, Superdex 200 16/600 size exclusion column (GE Healthcare, US) kan 200 mM NaCl buffer of keessaa qabu irratti fe’amee, achiis buffer walfakkaataa keessatti 1.5 CV irratti eluted ta’e. Ispeektaroota xuuxuu firaakshinii guddinaa ala ta’e walitti qabuu, fi ispeektaroota xuuxuu reeshiyoo A880/A280 2.4 fi reeshiyoo A880/A805 5.8 hanga 100 A880 irratti walitti qabuu, fi battalumatti qophii ykn kuusaa giiridii cryo-TEM fayyadamuu Hanga barbaachisutti -80°C irratti kaa’i.
Meembraaniin bulbulamaa gosa PufW-His irraa argame tarree HisPrep FF Ni-NTA Sepharose 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) 200 mM NaCl fi 0.03% (w/w) of keessaa qabu) IMAC buffer ( GE Healthcare) keessatti dibame. v) β-DDM jedhamuun beekama]. Tarreen kun CV shan IMAC buffer, achiis CV shan IMAC buffer 10 mM histidine of keessaa qabuun dhiqame. Kompileeksiin wiirtuu IMAC buffers shan 100 mM histidine of keessaa qabuun tarree irraa eluted ture. Firaakshiniin kompileeksii RC-LH114-W of keessaa qabu taankii sochoofame kan filtara Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK) qabu keessatti hanga ~10 mltti walitti qabamee, baafaara hidhuutiin yeroo 20 diilalla’ee, sana booda gara 25 mltti dabalamee Tarree DEAE Sepharose keessatti CV afur baafaratti hidhaman dursanii fayyadamu. Tarree sana baafaroota hidhuu CV afuriin dhiqadhu, sana booda kompileeksii CV saddeet irratti sarara 0 hanga 100 mM NaCl (baafaara hidhuu keessatti) irratti, fi CV afran hafan baafaara hidhuu 100 mM of keessaa qaban Kompileeksoonni haftee soodiyeem kilooraayidii irratti dhiqaman reeshiyoo A880/A280 2.4 ol ta’een walitti makamee fi kan Reeshiyoon A880/A805 firaakshinii 4.6 ol ta’e filtara seentirifuugal Amicon 100,000 MWCO keessatti gara ~2 ml tti walitti qabamee, dursanii IMAC 1.5 CV tiin guutamee Buffer equilibrated Superdex 200 16/600 size exclusion column, achiis buffer walfakkaataa keessatti 1.5 CV irratti eluted. Ispeektaroota xuuxuu firaakshinoota guddina-dhiifamuu walitti qabuu fi ispeektaroota xuuxuu reeshiyoo A880/A280 2.1 ol fi reeshiyoo A880/A805 4.6 hanga 100 A880 irratti walitti qabuu, isaanis battalumatti qophii giiridii TEM qorraaf kan oolu ykn hanga barbaachisummaa isaatti -80°C irratti kuufamuu.
Giriidii TEM ho’a gadi aanaa qopheessuuf Leica EM GP immersion freezer fayyadameera. Kompileeksiin kun IMAC baafaara keessatti gara A880 50tti kan diilalla’e yoo ta’u, sana booda 5μl meeshaa sibiila diimaa QUANTIFOIL 1.2/1.3 kaarboonii-coated haaraa glow-discharged (Agar Scientific, UK) irratti fe’ame. Giriidicha 20°C fi jiidhina %60 irratti s 30f inkuubeer gochuu, sana booda s 3f gogsuu, achiis dhangala’aa eeteen keessatti -176°C irratti dhaamsuu.
Daataan kompileeksii RC-LH114-W eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) irratti maaykirooskooppii Titan Krios, kan voolteejii ariifachiisaa 300kV irratti hojjetu, guddina maqaa 130,000× fi anniisaa- Qaawwa 20 eV filadhu. Fakkiiwwan haala lakkaa’aatiin galmeessuun daataa walitti qabuuf Gatan 968 GIF Quantum kan K2 peak detector qabu fayyadameera. Guddinni piikselii safarame 1.048Å, fi saffisi doosiin 3.83 e-Å-2s-1 dha. Fiilmii kana sekondii 11 keessatti walitti qabuun kutaa 40tti qoode. Naannoo kaarbooniin dibame fayyadamii maaykirooskooppii irra deebi’ii xiyyeeffadhu, achiis boolla tokkotti fiilmii sadii walitti qabi. Walumaagalatti fiilmiiwwan 3130 kan walitti qabaman yoo ta’u, gatiiwwan xiyyeeffannoo dhabuu -1 fi -3μm gidduutti argamu.
Daataan kompileeksii RC-LH116 maaykirooskooppii walfakkaatu fayyadamuun Laaboraatoorii Baayoostiraakcharii Asterbury (University of Leeds, UK) keessatti walitti qabame. Daataan haala lakkaa’uudhaan guddina 130 k waliin kan walitti qabame yoo ta’u, guddinni piikselii doosiin 4.6 e-Å-2s-1 ta’een gara 1.065 Å tti safarame. Fiilmiin kun sekondii 12 keessatti waraabamee kutaa 48tti qoodameera. Walumaagalatti, fiilmiiwwan 3359 kan walitti qabaman yoo ta’u, gatiiwwan xiyyeeffannoo dhabuu -1 fi -3μm gidduutti argamu.
Adeemsi daataa hundi sarara ujummoo Relion 3.0 keessatti raawwatama (42). Sochii biimii ulfaatina doosiin sirreessuuf Motioncorr 2 (43) fayyadami, sana booda CTFFIND 4.1 (44) fayyadamuun paarameetira CTF (faankishinii dabarsuu walfaallaa) murteessuu. Footoomaayikiroogiraafiiwwan idilee sadarkaalee adeemsa jalqabaa kana booda fakkii 2. S16. Unkaan filannoo ofumaan kan uumamu gara piikselii 250 kanneen paartiikilii 1000 ta’an furmaata piikselii 250 keessatti fi ramaddii wabii diimeshinii lamaa (2D) hin qabne harkaan filachuudhaan yoo ta’u, kanaanis ramaddiiwwan faalama saamudaa guutan ykn amala adda baafamuu danda’u hin qabne ni dida. Sana booda, filannoo ofumaan maaykiroofootoogiraafii hunda irratti kan raawwatame yoo ta’u, RC-LH114-W paartiikilii 849,359, kompileeksiin RC-LH116 ammoo paartiikilii 476,547 ture. Partikiloonni filataman hundi marsaa lama ramaddii 2D wabii hin taane keessa darbaniiru, fiigicha tokkoon tokkoon booda, paartiikiliin naannoo kaarboonii qunnaman, faalama saamudaa, amala ifa ta’e hin qabne ykn paartiikiliin ciminaan wal-irratti wal-caalu ni dida, bu’aan isaas 772,033 (%90.9) fi 359,678 (%75.5) ) Particles are used for 3D classification of RC-LH114-W fi RC-LH116 akkaataa walduraa duubaan. Moodeelli wabii 3D jalqabaa mala gadi bu’iinsa giraadiyeentii istookaastikii fayyadamuun uumameera. Moodeela jalqabaa akka wabii fayyadamuun, paartiikiliin filataman 3D keessatti bakka afuritti ramadamu. Moodeela gosa kana keessa jiru akka wabii fayyadamuun, 3D qulqulleessuu paartiikilii gosa guddaa keessa jiran irratti raawwadhu, sana booda naannoo furdaa uwwisuuf filtara darbiinsa gadi aanaa jalqabaa 15Å fayyadami, qarqara lallaafaa piikselii 6 itti dabali, fi piikselii booda adeemsisuun faankishinii dabarsoo Modulation fiixee Gatan K2 kan deeteektara gubbaa sirreessuuf. Kuusaa deetaa RC-LH114-W tiif, moodeelli jalqabaa kun dhangala’aa cimaa qarqara haguuggii (UCSF Chimera keessatti dhangala’aa walxaxaa wiirtuu irraa addaan cite) balleessuun fooyya’eera. Moodeelotni bu’aa argaman (furteen RC-LH114-W fi RC-LH116 3.91 fi 4.16 Å, akkaataa walduraa duubaan) akka wabii marsaa lammaffaa ramaddii 3D fayyadamu. Partikiloonni fayyadaman gita 3D jalqabaa keessatti kan garee ta’an yoo ta’u, ollaa wajjin walitti dhufeenya cimaa hin qaban. Wal-irra bu’uu ykn amala caasaa ifa ta’e dhabuu. Ramaddii 3D marsaa lammaffaa booda, gosti murtee olaanaa qabu filatameera [RC-LH114-W tiif, gosti tokko paartiikilii 377,703 (%44.5), RC-LH116 tiif, gosootni lama jiru, walumaa galatti paartiikilii 260,752 (%54.7) , Bakka isaan walfakkaataa ta’an yeroo naanneffannaa jalqabaa booda garaagarummaa xiqqaadhaan qofa qindaa’an]. Partikiloonni filataman saanduqa piikselii 400 keessatti irra deebi’anii baafamanii 3D qulqulleessuun qulqullaa’u. Haguuggiin furdaa filtara darbiinsa gadi aanaa jalqabaa 15Å, babal’ina kaartaa piikselii 3 fi haguuggii lallaafaa piikselii 3 fayyadamuun uuma. Fooyya’iinsa CTF paartiikilii tokkoo fayyadamuun, sirreeffama sochii paartiikilii tokkoo fi fooyya’iinsa CTF paartiikilii tokkoof marsaa lammaffaa, fooyya’iinsa 3D, haguuggii furdaa fi adeemsa boodaa tarkaanfii tokkoon tokkoon booda raawwatamee, teekchara bu’aa argamu caalaatti fooyyessuuf. Gatii kutaa FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) 0.143 fayyadamuun, murtoon moodeelota dhumaa RC-LH114-W fi RC-LH116 akkaataa walduraa duubaan 2.65 fi 2.80Å dha. Kaarviin FSC moodeela dhumaa fakkii 2. S17 irratti agarsiifameera.
Tartiiba pirootiinii hundi UniProtKB irraa kan buufamu: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID Yuunivarsiitii: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID YuuniProot: O83005); RC-M (PufM; ID YuuniProot: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt: A0A4Z9); Pirootiinii-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) moodeela homology RC ijaaruuf itti fayyadameera, kunis tartiiba pirootiinii RC-L, RC-M fi RC-H fi caasaa kiristaala Rba of keessaa qaba. sphaeroides RC akka unkaatti fayyadameera (PDB ID: 5LSE) (46). Meeshaa “kaartaa walsimsiisu” UCSF Chimera keessatti fayyadamuun moodeela uumame kaartaa (47) wajjin walsimsiisuuf, caasaa pirootiinii fooyyessuu, fi koofaaktariin [4×BChl a (maqaa haftee mana kitaabaa monoomarii = BCL), 2×BPh a (BPH), gosa tokko ykn lama UQ10 (U10), sibiilli heemii hin taane tokko (Fe) fi 3,4-dihydrohexacarbonylcholine tokko (QAK)] itti dabaluuf Coot (48) fayyadamuu. QAK mana kitaabaa monoomarii keessatti waan hin argamneef, meeshaa eLBOW PHENIX (49) keessatti fayyadamuun parameetarii ta’eera.
Itti aansuudhaan, subunitiin LH1 ijaarame. Jalqaba irratti meeshaan ijaarsa ofumaan PHENIX (49) keessatti argamu kaartaa fi tartiiba pirootiinii LH1-α fi LH1-β akka galteetti fayyadamuun kutaa tartiiba LH1 ofumaan ijaaruuf itti fayyadameera. Subunitii LH1 isa hunda caalaa guutuu ta’e filadhu, baasuun gara Coot tti fe’uu, tartiiba isa keessa jiru harkaan dabaluu, fi BCls lama a (BCL) fi spirilloxanthin (CRT) dabaluu dura caasaa guutuu harkaan fooyyessuu [akkaataa Rps barbaachisaa ta’etti Dandeettii kompileeksii LH1 fi qabiyyee karootinooyidii beekamaa. Gosa (17)]. Subunitii LH1 guutuu waraabi, fi UCSF Chimera “Docking Map Tool” fayyadamuun naannoo moodeela hin taane itti aanu kan LH1 density keessatti dock gochuu, achiis Coot keessatti fooyyessuu; hanga subunitoonni LH1 hundi moodeela ta’anitti adeemsa kana irra deebi’aa. Caasaa RC-LH114-W tiif, dhangala’aa hin ramadamne Coot keessatti baasuudhaan, pirootiinichi kaartaa USCF Chimera keessatti qaamolee pirootiinii hin taane hafan irraa qoodamee meeshaan Autobuild moodeela jalqabaa hundeessuuf kan gargaaru yoo ta’u, yuunitii xiqqaa hafan (pirootiinii-W) Moodeela. PHENIX (49) keessatti. Tartiiba dhabame kamiyyuu moodeela bu’aa Coot (48) keessatti argamutti dabali, achiis harkaan guutummaa yuunitii xiqqaa qulqulleessi. Density hin ramadamne hafe walnyaatinsa lipiidotaa (PDB monomer library ID of CDL = CDL, POPC = 6PL fi POPG = PGT), β-DDM detergent (LMT) fi UQ10 molecules (U10) wajjin wal sima. Hanga istaatiksii moodeela fi qulqullinni mul’ataa walsimsiisaa daran fooyya’uu hin dandeenyetti moodeela jalqabaa guutuu fiixaan baasuuf PHENIX optimization (49) fi manual optimization Coot (48) keessatti fayyadamuu. Dhumarratti, kaartaa naannoo qaruuf LocScale (50) fayyadami, achiis marsaa biroo hedduu kanneen dhangala'aa hin ramadamne moodeela gochuu fi ofumaan fi harkaan fooyyessuu raawwadhu.
Peeptiidonni, koofaaktarootaa fi lipiidotaa fi kinoonoonni biroo dhangala’aa isaanii keessatti dookii ta’an fakkii 1 fi 2 irratti agarsiifamaniiru.S18 hanga S23. Odeeffannoon istaatiksii moodeela dhumaa gabatee S1 irratti agarsiifameera.
Yoo haala biraatiin ibsame malee, ispeektaroonni xuuxuu UV/Vis/NIR ispeektaroofootoomeetira Cary60 (Agilent, USA) irratti 1 nm gidduutti 250 nm hanga 1000 nm fi yeroo ida’amuu 0.1s walitti qabamaniiru.
Saamuda kiyuuveetii koowartii keessatti daandii mm 2 gara A880 1tti diilalla’uu, fi ispeektirii xuuxuu 400 fi 1000 nm gidduutti walitti qabuu. Ispeektaroonni geengoo daayikirooyik ispeektaroopoolaariimeetira Jaaskoo 810 (Jaaskoo, Jaappaan) irratti 1 nm gidduutti 400 nm fi 950 nm gidduutti saffisa iskaan 20 nm min-1n walitti qabamaniiru.
Koofiishiin dhabamsiisa moolaarii kan murtaa’u kompileeksii wiirtuu gara A880 tilmaamaan 50tti diilalla’uudhaani.Ulmii 10μl baafaara hidhuu 990μl ykn meetaanoolii keessatti diilalla’uu, fi ispeektirii xuuxuu battalumatti walitti qabuun diigamuu BChl xiqqeessuu. Qabiyyeen BChl tokkoon tokkoon saamuda meetaanoolii koofiishinii dhabamsiisuu 771 nm 54.8 mM-1 cm-1 irratti shallagamee, koofiishiin dhabamsiisuu murtaa’eera (51). Xiyyeeffannoo BChl safarame 32 (RC-LH114-W) ykn 36 (RC-LH116)tti qooduun qindoomina kompileeksii wiirtuu murteessuu, kana booda ispeektirii xuuxuu saamuda walfakkaataa baafaara Koofiishinii Dhabamiinsa baafaara keessatti walitti qabame murteessuuf itti fayyadama. wal cina. Tokkoon tokkoon saamudaaf safartuuwwan irra deddeebi’aman sadii kan fudhataman yoo ta’u, shallaggiidhaaf giddugaleessa xuuxamuu ol’aanaa BChl Qy fayyadameera. Koofiishiin dhabamsiisaa RC-LH114-W 878 nm irratti safarame 3280±140 mM-1 cm-1 yoo ta’u, koofiishiin dhabamsiisaa RC-LH116 880 nm irratti safarame 3800±30 mM-1 cm-1 dha.
UQ10 akkaataa mala (52) keessatti ibsameen lakkoofsi isaa murtaa’eera. Gabaabumatti, HPLC marsaa duubatti deebi’uu (RP-HPLC) sirna Agilent 1200 HPLC fayyadamuun raawwatameera. Gara 0.02 nmol RC-LH116 ykn RC-LH114-W 50μl meetaanoolii:kiloorofoormii 50:50 feerik kilooraayidii 0.02% (w/v) of keessaa qabu keessatti bulbulaa, fi dursee madaalame Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm HPLC keessatti 40°C irratti 1 ml-1 min-1 keessatti bulbulaa furdaa (80:20 meetaanoolii:2-pirooppaanoolii) tarree ×25 cm irratti. Xuuxuu 275 nm (UQ10), 450 nm (karoteenoyidii) fi 780 nm (BChl) irratti sa’aatii 1f hordofuuf furdaa HPLC keessatti isocratic elution raawwachuu. Piikiin kiroomaatoogiraamii 275 nm keessatti daqiiqaa 25.5 irratti kan walitti makame yoo ta’u, kunis kompaawundoota biroo adda baafamuu danda’an kan hin qabne ture. Naannoo walitti makame kun kaarvii safartuu istaandaardii qulqulluu 0 hanga 5.8 nmol lilmoo irraa shallagame eeruun hamma moolaa UQ10 baafame shallaguuf kan gargaarudha (Fakkii S14). Tokkoon tokkoon saamudaa irra deddeebiin sadii kan xiinxalame yoo ta’u, dogongorri gabaafame SD giddugaleessaa wajjin walsima.
Furmaanni kompileeksii RC-LH1 kan xuuxamuu Qy ol’aanaa 0.1 qabu 30 μM hir’ate saayitookiroomii onnee fardaa c2 (Merck, UK) fi 0 hanga 50 μMUQ2 (Merck, UK) waliin qophaa’e. Tokkoon tokkoon qindoomina UQ2 irratti saamuda 1-ml sadii qophaa’ee halkan guutuu dukkana keessatti 4°C irratti inkuubeer ta’uun safartuu dura dukkanatti guutummaatti madaqfamuu mirkaneessuuf. Furmaanni kun OLIS RSM1000 modular spectrophotometer kan 300 nm flame/500 line grating, 1.24 mm seensa, 0.12 mm gidduu fi 0.6 mm outlet slits qabutti fe’ameera. Filtarri darbiinsa dheeraa 600 nm seensa foototuubii saamudaa fi tuubii footomaaltiplaayira wabii irratti kaa’amee ifa kaka’umsaa akka hin dabalamneef ni kaa’ama. Xuuxamuun 550 nm irratti yeroo ida’amuu 0.15 s ta’een hordofameera. Ifni kaka’umsaa kun 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) irraa karaa keebilii faayibar optikii cimina %90 karaa too’ataa DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) kan bahu yoo ta’u, gara madda ifaatti kofa 90° of. Ifa jalqaba saamuda sanaan hin xuuxamne kamiyyuu deebisuuf, biimiin safartuu daawwitii faallaa ta’a. Ifa s 50 dura s 10 dura xuuxuu hordofuu. Sana booda xuuxamuun isaa dukkana keessatti s 60f dabalataan hordofamee hammam quinolol ofumaan cytochrome c23 + hir'isu madaalameera (daataa raw ilaaluuf Fakkii S8 ilaali).
Daataan kan adeemsifame saffisa jalqabaa sararaawaa s 0.5 hanga 10 keessatti (akka qindoomina UQ2 irratti hundaa’uun) walsimsiisuun fi saffisa saamuda sadan tokkoon tokkoon qindoomina UQ2 irratti giddugaleessa gochuun ture. Xiyyeeffannaan RC-LH1 kan shallagame koofiishinii dhabamsiisaa walfakkaataatiin saffisa gara gahumsa kaataalayitikii jijjiiruuf itti fayyadameera, Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) keessatti pilaantii irratti kan kaa’ame yoo ta’u, gatiiwwan Km fi Kcat mul’atan murteessuuf moodeela Michaelis-Menten waliin walsimsiifameera.
Safartuu xuuxuu darbaatiif, saamuda RC-LH1 IMAC buffer 50 mM soodiyeem askorbeet (Merck, USA) fi 0.4 mM Terbutin (Merck, USA) of keessaa qabu keessatti gara ~2μMtti diluted ture. Asiidiin askorbiik akka arjooma elektiroonii aarsaa ta’etti kan fayyadamu yoo ta’u, tert-butaclofen ammoo akka inhibiitara QBtti kan fayyadamu yoo ta’u, arjoomtuun RC inni guddaan adeemsa safartuu hunda keessatti akka hir’atu (jechuunis, footooksaayidii akka hin taane) mirkaneessuuf. Tilmaamaan saamuda 3 ml seelii naanneffamuu amala (gara 0.1 m daayameetira, 350 RPM) dheerina daandii optikaalaa 2 mm qabutti dabalamee saamuda daandii leezari keessa jiru yeroo gahaa madaqfamuu dukkanaa'aa paalsii kaka'umsaa gidduutti akka qabaatu mirkaneessa. Sirna leezari Ti: Saafaayirii (Spectra Physics, USA) guddisuuf ~100-fs laser pulses fayyadamuun saamuda 880 nm irratti saffisa irra deddeebi’uu 1 kHz (NIRf 20 nJ ykn Vis’f 100 nJ) kakaasuuf. Daataa walitti qabuun dura saamuda gara daqiiqaa 30f ifa kaka’umsaaf saaxilu. Saaxilamummaan QA inactivation ni fida (QA al tokko ykn lama hir’isuu danda’a). Garuu adeemsi kun yeroo dheeraaf madaqfamuu dukkanaa booda RC suuta suutaan gara sochii QAtti waan deebi’uuf duubatti deebi’uu akka danda’u hubadhaa. Ispeektaroota darbaa yeroo harkifannaa -10 hanga 7000 ps safaruuf ispeektiroomeetiriin Helios (Ultrafast Systems, USA) fayyadameera. Tuuta deetaa garee irraa baasuuf, sana booda walitti makuu fi sadarkaa isaa eeggachuuf sooftiweeri Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) fayyadami. Paakeejii sooftiweerii CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) fayyadamuun tuuta deetaa walitti makame fayyadamuun ispeektaroota adda addaa manca’iinsa waliin walqabatan argachuuf, ykn faankishinii deebii meeshaa waliin eksaapooneentoota hedduu walitti makuun jijjiirama ispeektaraa dheerina dalgee tokkoo Origin (OriginLab, USA) keessatti walsimsiisuuf fayyadami.
Akkuma armaan olitti ibsame (53), fiilmiin footosinteetikii kompileeksii LH1 of keessaa qabu kan RC fi anteenaa LH2 naannoo lamaanuu hin qabne qophaa’eera. Meembraaniin 20 mM tris (pH 8.0) keessatti diluted ta’ee booda gara quartz cuvette karaa optical 2 mm qabutti fe’ame. Yeroo harkifannaa -10 hanga 7000 ps ta’een saamuda 540 nm irratti kakaasuuf 30nJ laser pulse fayyadameera. Tuuta deetaa akka Rps ibsametti adeemsi. pal sample.
Meembraanichi 150,000 RCF irratti sa’aatii 2f 4°C irratti seentiriifiigeeshiniin peeleetii ta’ee, sana booda xuuxamuun isaa 880 nm irratti 20 mM tris-HCl (pH 8.0) fi 200 mM NaCl keessatti deebi’ee dhaabbate. Meembraanicha 2% (w/v) β-DDM keessatti sa’aatii 1f dukkana keessatti 4°C irratti suuta sochoosuun bulbulaa. Saamuda 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) keessatti hanga pirootiinii 2.5 mg ml-1 (Bio-Rad analysis)tti diilalla’e. Adeemsi dabalataa mala kanaan dura maxxanfame irraa (54) kan raawwatame yoo ta’u, pirootiinii 50 μg gara waliigala TEAB 50 μl kan soodiyeem laurate %1 (w/v) of keessaa qabutti dilution gochuu irraa eegalee (Merck, UK). Erga sonication 60 s, 5 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (Merck, UK) 37 ° C daqiiqaa 30f hir'ate. S-alkylation tiif, saamuda 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) waliin incubat gochuun 200 mM isopropanol stock solution irraa daqiiqaa 10f teempireechara kutaa keessatti itti dabaluun. Daakuun pirootiyoolayitikii makaa tiriipsinii/endopirootiiniise Lys-C 2 μg (Promega UK) itti dabaluudhaan 37°C irratti sa’aatii 3f inkuubeer gochuun raawwatameera. Surfaktantiin laurate 50 μl ethyl acetate fi 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) itti dabaluun s 60f vortexing gochuun baafameera. Addaan bahuun marsaa daqiiqaa 5f RCF 15,700 irratti seentiriifiigeeshiniin guddateera. Akka pirootokoolii oomishtootaatti, marsaa gadii peeptiidii of keessaa qabu of eeggannoodhaan aspiraashinii fi soogidda balleessuuf C18 spin column (Thermo Fisher Scientific, UK) fayyadameera. Erga vaakiyuumii seentiriifiigeeshiniin gogfamee booda, saamuda 0.5% TFA fi 3% aseetoonitraayilii keessatti kan bulbulame yoo ta’u, 500 ng ammoo naannoo dhangala’aa RP kiroomaatoogiraafii mass spectrometry waliin walqabatee paaraameetota sirnaa kanaan dura bal’inaan ibsaman fayyadamuun xiinxalameera.
Rps barbaaduuf pirootiinii adda baasuu fi baay’isuudhaaf MaxQuant v.1.5.3.30 (56) fayyadamuu. kuusa deetaa pirootiyoomii palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Daataan pirootiyoomiksii ispeektiroomeetirii baay’ee karaa kuusaa michuu PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) adda baastuu kuusaa deetaa PXD020402 jalatti ProteomeXchange Alliance keessatti kuufameera.
Xiinxala RPLC elektiroospray ayoonisaayizeeshinii maas ispeektiroomeetirii waliin walqabatee, kompileeksii RC-LH1 gosa bosona Rps irraa qophaa’e. Mala kanaan dura maxxanfame (16) fayyadamuun, qindoominni pirootiinii seelii palustris keessatti oomishame 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl fi 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis) ) DDM keessatti 2 mg ml-1 ture. Akka pirootokoolii oomishtootaatti, mala roobaatiin pirootiinii 10 μg baasuuf 2D purification kit (GE Healthcare, USA) fayyadamuun, rooba sana 20 μl 60% (v / v) formic acid (FA), 20% (v / v) Acetonitrile fi 20% (v/v) bishaan keessatti bulbulaa. Maaykiroolitaroonni shan RPLC (Dionex RSLC) kan maas ispeektiroomeetirii (Maxis UHR-TOF, Bruker) waliin walqabatee xiinxalamaniiru. 60°C fi 100μlmin -1 irratti addaan baasuuf tarree MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) fayyadamuu, garagalcha 85% (v / v) furdaa A [0.1% (v / v) FA fi 0.02% (V/v) TFA aqueous solution] hanga 85%(v/v) solvent B [0.1%(v/v) FA fi 0.02%(v/v) 90%(v/v) aseetoonitraayilii TFA keessatti] Madda ayoonisaayizeeshinii elektiroospray istaandaardii fi paarameeteroota durtii daqiiqaa 60 ol fayyadamuun, ispeektiroomeetiriin heddumminaa 100 hanga 2750 m/z (reeshiyoo heddumminaa-chaarjii) argata. Gargaarsa meeshaa poortala qabeenya baayooinformaatiksii ExPASy FindPept (https://web.expasy.org/findpept/) tiin, ispeektirii heddumminaa gara yuunitii xiqqaa kompileeksii kaartaan kaartaa.
Seelonni sa’aatii 72f ifa NF-gadi aanaa (10μMm-2 s-1), giddugaleessa (30μMm-2 s-1) ykn ol’aanaa (300μMm-2 s-1) 100 ml jalatti guddatan. Meediyaa M22 (Meediyaa M22 kan amooniyeem salfeet itti hafee fi soodiyeem suksiineetiin soodiyeem aseeteetiin bakka bu’e) qaruuraa 100 ml kan gubbaa iskiriyuu qabu (23) keessatti. Marsaa 30-s shan keessatti, 0.1 micron glass beads reeshiyoo volumii 1:1n beaded ta’ee seelii lyse gochuun daqiiqaa 5f ice irratti qabbanaa’e. Wanti hin bulbulamne, seelonni hin cabne fi biidiin geejjibaa daqiiqaa 10f RCF 16,000 irratti maaykiroo seentiriifiyuujii teessoo irratti seentiriifiigeeshiniin baafamaniiru. Meembraanichi rootarii Ti 70.1 keessatti RCF 100,000 20 mM tris-HCl (pH 8.0) keessatti 40/15% (w/w) sucrose gradient waliin sa’aatii 10f adda baafame.
Akkuma hojii keenya kanaan duraa keessatti ibsame, immunodetection of the His tag on PufW (16). Gabaabumatti, kompileeksii wiirtuu qulqullaa’e (11.8 nM) ykn meembraaniin qindoomina RC walfakkaataa of keessaa qabu (oksaayidii ispeektirii garaagarummaa hir’isuu fi fe’umsa jeel faalamee irratti walsimsiisuun murtaa’e) 2x SDS loading buffer (Merck, UK) keessatti yeroo lama diluted. Pirootinoonni kunneen jeel bis-tris NuPage %12 (Thermo Fisher Scientific, UK) fakkeessaa irratti adda baafamaniiru. Jeeliin tokko RC-L subunit fe’uu fi mul’isuuf Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) tiin faalameera. Pirootiiniin jeel lammaffaa irratti argamu qorannoo immunoassay gochuuf gara meembraanii poliiviiniiliidiinii filooraayidii meetaanooliin hojiirra oole (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, UK)tti jijjiirame. Meembraaniin PVDF 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 fi 5% (w / v) daakuu aannan qamadii keessatti ugguramee, sana booda farra qaama farra His jalqabaa (in Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6)) waliin inkuubeer ta’e, incubatted. 150 mM NaCl fi 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) keessatti sa’aatii 4f. Daqiiqaa 5f baafaara farra qaamaa keessatti yeroo 3 erga dhiqamee booda, meembraanichi farra hantuutaa lammaffaa farra hantuutaa horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) waliin walitti makame (baafara farra qaamaa keessatti 1:10,000 diluted) WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescence substrate fayyadamuun adda baasuu akka hayyamuuf (baafara farra qaamaa keessatti 3 dhiqamee booda daqiiqaa 5 booda) inkuubeer (Saayanajeen, Xaaliyaanii) fi Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK) jedhaman.
Raabsa cimina tokkoon tokkoon jeel faalamee ykn daandii immunoassay kaasuun, naannoo fiixee jala jiru walitti makuu fi reeshiyoo cimina RC-L (jeel faalamee) fi Pirootiinii-W (immunoassay) shallaguudhaan, ImageJ (57) keessatti Fakkii adeemsi. Reeshiyoon kunniin saamuda RC-LH114-W qulqulluu keessatti reeshiyoon RC-L fi pirootiinii-W 1:1 akka ta’e tilmaamuun guutummaa tuuta deetaa haala kanaan normalize gochuun gara reeshiyoo moolaariitti jijjiiramaniiru.
Barreeffama kanaaf meeshaalee dabalataa argachuuf, maaloo http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 ilaalaa
Kun barruu banaa ta'ee fi haalawwan Hayyama Amala Creative Commons jalatti raabsameedha. Barreeffamichi hojiin jalqabaa sirnaan caqasamuu isaatiin meeshaa kamiinuu itti fayyadamuu, raabsuu fi baay’isuu daangaa malee ni hayyama.
Hubachiisa: Namni ati fuula sanaaf gorsitu email sana akka argu akka barbaadduu fi spam akka hin taane akka beekuuf qofa teessoo email kee akka kennitu qofa si gaafanna. Teessoo email kamiyyuu hin qabannu.
Gaaffiin kun daawwataa ta'uu kee qorachuu fi ofumaan spam akka hin dhiyaanne ittisuuf kan gargaarudha.
Deevid J. K. Swainsbury, Paark Qian, Filip J. Jaaksan, Keetlin M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizaabeet C. Maartiin, Deevid A. Farmer, Loorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Niil A. Ranson, Daani’eel P Caniffe , Maark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andireew Hitchcock, C. Neil Hunter
Caasaan furmaata olaanaa kompileeksii kiyyoo ifaa 1 wiirtuu walnyaatinsaa keessatti argamu daayinamiksii kinoonii irratti hubannoo haaraa kenna.
Deevid J. K. Swainsbury, Paark Qian, Filip J. Jaaksan, Keetlin M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizaabeet C. Maartiin, Deevid A. Farmer, Loorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Niil A. Ranson, Daani’eel P Caniffe , Maark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andireew Hitchcock, C. Neil Hunter
Caasaan furmaata olaanaa kompileeksii kiyyoo ifaa 1 wiirtuu walnyaatinsaa keessatti argamu daayinamiksii kinoonii irratti hubannoo haaraa kenna.
©2021 Waldaa Guddina Saayinsii Ameerikaa. mirgi hunduu kan eegamedha. AAAS michuu HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef fi COUNTER ti. Guddina Saayinsii ISSN 2375-2548.